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Warum ist der relative Ausdruck in qPCR so niedrig?


Bei der Analyse verschiedener Mutationen durch qPCR fand ich den $2^{-DeltaDelta ct}$-Wert für jede Mutation. Alle Mutationen haben ähnliche Werte im Vergleich zum Wildtyp-Gen, jedoch hat eine der Mutationen einen extremen $2^{-DeltaDeltaDelta ct}$-Wert. Mit $1$ für den Wildtyp und durchschnittlich $0.9$ für einige mutierte Gene hat der Ausnahmefall einen Wert von $0.05$.

Ich denke, man könnte argumentieren, dass diese Mutation eine Sequenz aus dem Wildtyp-Gen löscht, aber ich glaube, dass daraus andere Dinge abgeleitet werden können.


Es kann sich um eine bestimmte Mutation handeln, die die Expression insgesamt beeinflusst. Durch qPCR können Sie den relativen Unterschied in den mRNA-Spiegeln eines bestimmten Gens beispielsweise zwischen einem WT und einer Mutante feststellen. Es kann sein, dass diese spezielle Mutation eine regulatorische Sequenz innerhalb des Körpers eines Gens (z. B. ein stromabwärts gelegenes Promotorelement) oder eine stromaufwärts gelegene regulatorische Sequenz schädigt. Für mich deutet dies darauf hin, dass Sie es hier mit einem solchen Fall zu tun haben. Wie auch immer, Sie benötigen mehr Daten, um sicher zu sein. Sie sollten die Mutation kartieren lassen, falls noch nicht geschehen, und prüfen, ob die verwendeten Primer in Ordnung waren. Diese Mutation behindert eindeutig die Expression, solange mit dem Verfahren alles in Ordnung war.


Kann qPCR absolut sein oder ist es nur eine relative Quantifizierung?

Ich bin kein Biologe, arbeite aber an Daten aus der digitalen Tröpfchen-PCR und versuche, qPCR vs. ddPCR zu verstehen.

ddPCR-Ressourcen sagen mir immer wieder, dass einer der Hauptvorteile von ddPCR darin besteht, dass es absolut Quantifizierung, während qPCR nur liefern kann relativ Quantifizierung. (Die Hauptseite von Bio-rad für ddPCR sagt das). Aber ich habe auch an vielen Stellen über qPCR gelesen, und es heißt immer, dass eine absolute Quantifizierung möglich ist, wenn Sie die Anfangskonzentration der Referenzprobe kennen (oder etwas in dieser Richtung - ich bin immer noch nicht zu 100% bei all diesen Konzepten) und Terminologie).

Also was ist es? Lügen ddPCR mich an, um ihr Produkt attraktiver zu machen? Oder ist die "absolute Quantifizierung" mit qPCR nicht so absolut wie mit ddPCR?

Ich denke, Sie verwechseln zwei Dinge - Quantitative Real-Time PCR (manchmal abgekürzt als qRT-PCR oder qPCR) kann Ihnen entweder absolute ODER relative Ergebnisse liefern, je nachdem, wie Sie Ihr Experiment durchführen, während die digitale Tröpfchen-PCR eine Technik ist, die verwendet werden kann zur absoluten Quantifizierung. Die meisten Leute machen relativ, da es einfacher ist und die genaue Kenntnis der Anzahl der Moleküle eines Gentranskripts nicht viel aussagekräftiger ist als die relative Expression eines Transkripts im Vergleich zu einer Kontrolle.

Für Absolute erstellen Sie eine Standardkurve von Standards unterschiedlicher Konzentration. Sie verdünnen das Ausgangsmaterial (cDNA) so, dass Sie dazu kommen, ein Transkript/eine Reaktion zu amplifizieren. Hier kann die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR) nützlich sein, da sie genau das ist – die Amplifikation eines einzelnen DNA-Strangs in einem Tröpfchen. Durch die Verwendung einer Standardkurve können Sie jedoch eine absolute Quantifizierung ohne ddPCR durchführen (sie sind nicht ein und dasselbe).

Bei Relativ vergleichen Sie eine Stichprobe mit einer anderen, sodass Sie keine Standardkurve benötigen, aber Sie benötigen ein Haushaltsgen, um sicherzustellen, dass Ihre Eingabe für jede Stichprobe gleich ist, da sie variieren kann. Für zB. Wenn Sie 2x Ihrer Kontrolle und 1x Ihrer experimentellen Probe einsetzen, zeigen die Daten, dass Sie 50 % weniger in Ihrem Experiment als bei der Kontrolle haben, obwohl sie wirklich 1:1 sein sollten. Ein Housekeeping-Gen normalisiert diesen Effekt.


Was ist der Sinn von ROX in der qPCR?

Da ROX ein passiver Fluoreszenzfarbstoff ist, wird er in der qPCR hauptsächlich zur Signalnormalisierung verwendet. Durch die Normalisierung des Fluoreszenzsignals kann dies die Variabilität zwischen technischen Replikaten reduzieren.

Leichte Variationen zwischen den Wells können das bei der qPCR erzeugte Fluoreszenzsignal beeinflussen. Beispielsweise können Unterschiede in den Reaktionsvolumina aufgrund von Pipettierfehlern die Ergebnisse verfälschen. Auch Probleme im Zusammenhang mit dem qPCR-Instrument, wie z. B. die Optik, können das erzeugte Fluoreszenzsignal beeinflussen.

Sie können sich den Normalisierungsprozess bei der Verwendung von ROX als ein ähnliches Konzept vorstellen, warum Referenzgene bei Berechnungen der relativen Genexpression verwendet werden, wie z. B. die Delta-Delta Ct-Methode. Anstatt die Menge an Template in der Probe zu kontrollieren, normalisiert ROX die Attribute der qPCR-Mischung, wie Volumenunterschiede, Vorhandensein von Blasen usw.


Wie man einen Kalibrator für die relative Genexpression in der real-time PCR auswählt - auch über die Inkonsistenz über das Triplikat der real-time PCR (25. August 2008)

Hallo, ihr Lieben,
Ich führe Echtzeit-PCR für die relative Expression von proinflammatorischen Zytokinen als Reaktion auf eine Infektion durch. Ich verwende die SDS-Software des ABI-Systems und SYBR Green. Das Versuchsdesign ist wie folgt: 0h (keine Infektion), 3h (Sammeln von RNA 3h nach Infektion), 6h (Sammeln von RNA 6h nach Infektion). Ich habe dreifache Proben für jeden Zeitpunkt. es gibt also 9 Proben 0h-1, 0h-2, 0h-3 3h-1, 3h-2, 3h-3 6h-1, 6h-2, 6h-3. Während der Datenanalyse muss ich eine der Nullzeitpunktproben als Kalibrator auswählen, dh ich setze den Wert dieser Probe auf 1. Ich setze 0h-1 auf 1 und der Wert von 0h-2 ist 0.7 , der Wert von 0h-3 ist 1,3.
Ich frage mich, ob ich 0h-2 als Kalibrator einstelle, dh der Wert von 0h-2 ist 1, also ändert sich der relative Ausdruckswert aller Proben und erhöht sich um das 1/0,7-fache. Bilden Sie die drei Nullpunktprobe, welche soll ich als Kalibrator wählen? Gibt es Regeln für die Kalibratorauswahl? Warum gibt es so große Unterschiede für die dreifachen Nullzeitpunktproben, die nicht infiziert wurden?
Danke im Voraus

in Anbetracht der hohen Varianz Ihres (unbehandelten) Kalibrators: ich gehe davon aus, dass die Zytokinexpression der nicht infizierten Zellen sehr gering bis nahe der Nachweisgrenze ist (Cts um 34 oder mehr). Darüber hinaus würde die Verwendung dieses Geräts als Kalibrator einen großen Fehler in Ihren Probenmessungen verursachen. Ich würde empfehlen, cDNA aus verschiedenen Behandlungsstadien zu bündeln, damit Sie eine Art durchschnittliches Expressionsniveau erhalten und dieses als Kalibrator verwenden. Sie können sogar den arithmetischen Mittelwert aller Proben-Cts berechnen und diesen als Kalibrator verwenden. Die Zahlen können unterschiedlich sein, aber die relativen Mengen sind immer gleich.

Übrigens: Sie würden als Kalibrator den arithmetischen Mittelwert Ct Ihrer drei 0h-Proben nehmen, nicht nur eine

Hallo, wir hatten das gleiche Problem bei der Durchführung von RT-qCR zur Analyse der Citokin-Expression und haben uns damals entschieden, den Kalibrator zu vermeiden und stattdessen das 2^-ddCT zu berechnen, das wir mit dem ddCT arbeiteten, also unsere Ergebnisse waren genauer, da wir uns aufgrund des hohen CT-Werts keine Sorgen um die Standardabweichung zwischen den Kalibrierungsproben machen mussten. In letzter Zeit arbeiten wir mit ELISA, es ist viel einfacher und noch genauer, wenn Sie wissen müssen, ob ein bestimmtes Citokin mit der Zeit ansteigt. Viel Glück

in Anbetracht der hohen Varianz Ihres (unbehandelten) Kalibrators: Ich gehe davon aus, dass die Zytokinexpression der nicht infizierten Zellen sehr gering bis nahe der Nachweisgrenze ist (Cts um 34 oder mehr). Darüber hinaus würde die Verwendung dieses Geräts als Kalibrator einen großen Fehler in Ihren Probenmessungen verursachen. Ich würde empfehlen, cDNA aus verschiedenen Behandlungsstadien zu bündeln, damit Sie eine Art durchschnittliches Expressionsniveau erhalten und dieses als Kalibrator verwenden. Sie können sogar den arithmetischen Mittelwert aller Proben-Cts berechnen und diesen als Kalibrator verwenden. Die Zahlen können unterschiedlich sein, aber die relativen Mengen sind immer gleich.

Übrigens: Sie würden als Kalibrator den arithmetischen Mittelwert Ct Ihrer drei 0h-Proben nehmen, nicht nur eine

Hallo Ned Land, vielen Dank für Ihre netten Vorschläge. Dies ist das erste Mal, dass ich gehört habe, dass Pool-cDNA aus verschiedenen Behandlungsstadien als Kalibrator in der qPCR verwendet wird. Ich frage mich jedoch, wie ich den relativen Ausdruck dieses Vergleichs erklären soll. Denn was ich wissen möchte, ist zu sehen, ob eine Behandlung wie eine Infektion die Expression eines bestimmten Zytokins stimulieren oder verringern kann. also vergleiche ich das Expressionsniveau der behandelten Gruppe mit der nicht behandelten Gruppe (hier bezeichne ich als 0h) und erhalte das relative Expressionsniveau. Welche Bedeutung hat es also, das Expressionsniveau einer bestimmten behandelten Gruppe mit der Pool-cDNA zu vergleichen? wenn das Expressionsniveau einer bestimmten behandelten Gruppe höher als das durchschnittliche Expressionsniveau ist, können wir vielleicht sagen, dass die Behandlung die Expression erhöht. Wenn jedoch das Expressionsniveau einer bestimmten behandelten Gruppe niedriger ist als das durchschnittliche Expressionsniveau, bedeutet dies nicht, dass die Behandlung die Expression verringert.

Ich denke auch, dass es besser wäre, den arithmetischen Mittelwert Ct der drei 0h-Proben als Kalibrator zu nehmen, ich möchte wissen, wie das in der ABI SDS-Software geht. es scheint, dass nur eine Probe als Kalibrator in der SDS-Software ausgewählt werden kann.

Hallo, ich bin verblüfft über Ihre Aussage, dass Sie stattdessen mit dem ddCT gearbeitet haben. Könnten Sie bitte näher erläutern, wie Sie die relativen Expressionsdaten analysieren. Vielen Dank

kannst du ein paar zusätzliche informationen geben? Was sind Ihre Cts der 0h, 3h, 6h Zeitpunkte?

Auch hier ändert die Wahl des Kalibrators nichts an Ihren relativen Quantifizierungsergebnissen. Es ist eher eine kosmetische Operation.

Letztlich spielt es keine Rolle, welche Probe Sie als Kalibrator nehmen. der Kalibrator sollte nur die folgenden Eigenschaften haben:
-alle interessierenden Gene müssen im Kalibrator exprimiert werden
- genügend Probenmaterial des Kalibrators während der gesamten Studie verfügbar ist

So können Sie auch ein Aliquot aller Proben mischen und als Kalibrator verwenden.


4 Experimentelle Verfahren

4.1 Aufzucht von Mücken

Ä. Ägypter Der Liverpool-Stamm (ein Geschenk von E. Devaney, University of Glasgow, UK) wurde bei 28 °C und 80 % Luftfeuchtigkeit mit einer 12:12-Licht-Photoperiode aufgezogen. Die Larven wurden in Wasser aufgezogen und vom Schlüpfen der Larven bis zum Puppenstadium mit Katzentrockenfutter gefüttert. Die aufkommenden adulten Stechmücken wurden in Käfige mit unbegrenztem Zugang zu 10 Gew./Vol. Saccharoselösung überführt. Weibliche Mücken wurden mit heparinisiertem Kaninchenblut (Orygen Antibodies Ltd) unter Verwendung eines Hemotek-Systems (Hemotek Ltd, UK) gefüttert.

4.2 Zellkultur

Ä. Ägypter-abgeleitete Aag2-Zellen (ein freundliches Geschenk von P. Eggleston, Keele University, UK) wurden in Leibowitz L-15-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Gibco), 10 % Tryptosephosphat-Brühe (TPB, Gibco) und gehalten Penicillin-Streptomycin (Gibco). Mückenzellen wurden bei 28 °C gehalten.

4.3 dsRNA-Design, Synthese und Reinigung für die Mückeninjektion

Gesamt-RNA wurde mit TRIzol (Thermo Fisher Scientific) aus ganzem NBF . extrahiert Ä. Ägypter Weibchen nach Herstellerangaben mit 1-Brom-3-chlorpropan (Sigma) anstelle von Chloroform und inklusive DNase-Behandlung (TURBO DNase, Ambion). cDNA wurde aus 1 &mgr;g Gesamt-RNA unter Verwendung von MMLV-Retro-Transkriptase (Thermoscience) und Zufallshexameren pDN6 (Invitrogen) erzeugt. cDNA wurde für die Produktion der dsRNAs-Targeting verwendet p400, E75 und vor2 Gene und das Plasmid-Template DrosophilaFür dsLacZ (verwendet als Kontroll-dsRNA) wurde act5C-βGal (Bestandsnummer 1220, erhalten von DGRC) verwendet. dsRNA wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (McFarlane et al., 2020) unter Verwendung genspezifischer Primer mit T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz (Tabelle S1). dsp400-1, dsago2, dsE75-1 und dsE75-2 (beide zielen auf alle E75-Isoformen ab) wurden mit dem E-RNAi-Webservice (https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/0) entworfen und ungefähr die gleiche Größe haben, um den Größeneffekt auszuschließen. dsp400-2 wurde zuvor entwickelt (McFarlane et al., 2020 ).

4.4 siRNA-Design, Produktion und Vorbereitung

Das siRNA-Targeting vor2 (siago2) wurde basierend auf der vorherigen Studie in Ä. Ägypter-abgeleitete Zelllinie (Varjak et al., 2017). Die auf βGal abzielende siRNA (siLacZ, als Kontrolle verwendet) wurde von Dharmacon (# D-002000-01-20) entwickelt. Sequenzen von siRNAs sind in Tabelle S2 zu finden. siRNAs wurden entweder für Standard oder hergestellt und gereinigt in vivo Anwendung (Dharmacon). siRNA für die Standardanwendung wurde als entsalzter Duplex gebrauchsfertig nach Resuspendierung bereitgestellt. siRNA für in vivo Anwendung wurden durch Gegenionenaustausch (Na+) verarbeitet, entsalzt, steril filtriert und auf Endotoxin getestet. siRNAs wurden in nukleasefreiem PBS oder Wasser nach Dharmacons Anweisungen resuspendiert, aliquotiert und bei –20 °C gelagert.

4.5 Sequenzierung

Um zu überprüfen, ob die siago2-Sequenz mit der Ä. Ägypter Liverpool-Stamm, der in dieser Studie verwendet wurde, cDNA aus ganzen Ä. Ägypter Weibchen wurde verwendet, um die entsprechende Genregion durch PCR unter Verwendung von KOD HOT Start Mastermix (Sigma) und spezifischen Primern (Tabelle S1) zu amplifizieren. Das PCR-Fragment wurde unter Verwendung des QIAquick-Gelextraktionskits (Qiagen) gelgereinigt und in pJET-Plasmid (Thermo Scientific) ligiert und in JM109-kompetente Bakterien (Promega) transformiert. Transformierte Bakterien wurden über Nacht in mit Ampicillin ergänzten LB-Medien kultiviert. Plasmid-DNA wurde aus Kolonien unter Verwendung des QIAquick-Miniprep-Kits (Qiagen) extrahiert. Die Sequenzierung des Inserts wurde von Source Bioscience durchgeführt. Die Sequenzübereinstimmung mit der siRNA-Sequenz wurde mit der Serial Cloner-Software v2.6.1 analysiert.

4.6 dsRNA- und siRNA-Injektion in Mücken und Probenahme

1–2 Tage nach dem Auflaufen wurden kalt betäubte weibliche Mücken (n = 15–20 pro Bedingung und Replikat) mit einem Nanoinjektor (Nanoject II, Drummond Scientific) injiziert. Cellfectin® II (Thermofisher) oder DharmaFECT2 (Horizon Discovery) Transfektionsreagenz wurde mit S2-Medium (Life Technologies) (1:1, Vol:Vol) gemischt. Nach 5 min Inkubation wurde diese Mischung zu einer zuvor mit S2-Medium eingestellten dsRNA/siRNA-Lösung (1:1, Vol:Vol) gegeben, um die erforderliche Menge an dsRNA/siRNA pro weiblichem/Injektionsvolumen zu ergeben. Die Injektionslösung wurde dann vor der Injektion 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Für Bedingungen ohne Transfektionsreagenz wurde die dsRNA-Lösung mit S2-Medium eingestellt, um die erforderliche Menge an dsRNA/siRNA pro weiblicher/Injektionsvolumen zu ergeben. Nach der Injektion wurden die Moskitos in Netzkartons mit Wattebäuschen, die mit 10 % Saccharose benetzt waren, zur Erholung gelassen. Um das Risiko einer bakteriellen Infektion nach der Injektion zu verringern, wurden die injizierten Mücken 24 h bei 21 °C und 80 % Luftfeuchtigkeit belassen und dann auf 28 °C und 80 % Luftfeuchtigkeit gebracht. Vier Tage nach der Injektion wurden 10 Moskitos in 1 ml TRIzol-Reagens (Thermo Fisher Scientific) mit Glaskügelchen unter Verwendung des Precellys 24 Homogenisators (Bertin Instruments) vor der RNA-Extraktion homogenisiert.

4.7 Analyse des Mückenüberlebens

Die Wirkung der Injektion mit verschiedenen Reagenzien auf das Überleben der Mücken wurde untersucht, indem 40–50 Mücken pro Bedingung und Wiederholung injiziert wurden. Für alle Bedingungen wurde das gleiche Endvolumen (414 nl) injiziert. Bei Verwendung von dsRNA oder siRNA wurde ebenfalls für alle Bedingungen die gleiche Menge (2 µg) injiziert. Das Überleben wurde 3 Tage lang überwacht, indem tote Moskitos gezählt und durch Aspiration entfernt wurden.

4.8 Zelltransfektion und Probenahme

1,7 × 10 5 Aag2-Zellen wurden in 24-Well-Platten ausplattiert. Der folgende Morgen, LacZ und vor2 Targeting-siRNAs (5 ng/μl final) wurden mit Dharmafect2 (Horizon Discovery) gemäß Herstellerprotokoll in die Aag2-Zellen transfiziert. siRNA-behandelten Zellen wurden 1 Tag nach der Transfektion Proben entnommen. Die Zellen wurden bei 4 °C und 400× . zentrifugiertg für 10min. Die Zellmedien wurden dann zur weiteren RNA-Extraktion durch 1 ml TRIzol (Thermo Fisher Scientific) ersetzt.

4.9 RNA-Extraktion und Reverse-Transkription

Gesamt-RNA aus siRNA-behandelten Zellen und ganzen Weibchen wurde mit TRIzol (Thermo Fisher Scientific) nach den Anweisungen des Herstellers mit 1-Brom-3-chlorpropan (Sigma) anstelle von Chloroform und einer DNAse-Behandlung (TURBO DNase-Kit, Ambion) extrahiert. cDNA wurde aus 1 µg Gesamt-RNA in 40 µl durch reverse Transkription (RT) unter Verwendung der MMLV Reverse Transcriptase (Thermoscience) und Zufallshexameren pDN6 (Invitrogen) nach Herstellerprotokoll erzeugt. Für jede Probe wurden 3 unabhängige RTs (weiter gepoolt) und 1 negative reverse Transkriptionskontrolle (NRT) hergestellt. Die NRT umfasst alle Reagenzien außer der reversen Transkriptase, die durch Wasser ersetzt wurde. cDNAs wurden bei -20 °C in 2,8-μl-Aliquots für die weitere qPCR-Analyse aufbewahrt.

4.10 qPCR-Analyse

Die qPCR wurde unter Verwendung von 2,8 ul cDNA-Aliquots mit FAST SYBR Green Mastermix (Applied Biosystems) gemäß den Anweisungen des Herstellers und unter Verwendung der 7500 Fast PCR Machine (Applied Biosystems) durchgeführt. Primer, die zur Überprüfung der Knock-Down-Effizienz verwendet wurden, wurden so entworfen, dass sie außerhalb der dsRNA-Regionen liegen, um eine dsRNA-Amplifikation zu vermeiden, und sind in Tabelle S1 aufgeführt. Die Ergebnisse wurden mit der 7500 Software v2.0.6 behandelt und wie zuvor beschrieben analysiert (Taylor et al., 2019). Das ribosomale S7-Transkript wurde als Referenz für die normalisierten Expressionswerte verwendet, und der Geomean der dsLacZ-Kontrollgruppe wurde auf 1 gesetzt. Das RQ-Minimum und -Maximum wurden aus dem Geomean berechnet und als Fehlerbalken angezeigt. Für jedes Experiment wurden Daten von 3 biologischen Replikaten und 10 Weibchen, die pro Bedingung und Replikat gepoolt wurden, erhalten.

4.11 statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit der Software Graph Pad v7.02 durchgeführt. Mückenüberlebensanalysen wurden mit einer Überlebenskurve und einem Log-Rank-Mantel-Cox-Test durchgeführt. Die Analyse der qPCR-Daten erfolgte mit ungepaarten und zweiseitigen T-Tests auf Log2-normalisierte Ausdruckswerte nach Taylors Methode (Taylor et al., 2019 ).


Techniken für RNA-Expressionsstudien

Das RNA-Profiling basiert auf einer Reihe von Methoden, von denen einige relativ einfach durchzuführen sind, andere viel komplexer, einige auf einen geringen Durchsatz beschränkt sind und andere die parallele Verarbeitung zahlreicher Proben ermöglichen.

  1. Die PCR ist eine Basistechnologie für die meisten derzeit verwendeten Methoden, und die Endpunkt-PCR, die mittels Gelelektrophorese analysiert wird, wird trotz ihrer begrenzten Quantifizierungskapazität auch heute noch verwendet. Das Bewusstsein für Variabilitätsprobleme im Zusammenhang mit PCR ist seit langem bekannt, wobei der erste Bericht bereits 1992 Inkonsistenzen mit Replikat- und Serienproben beschrieb, die innerhalb und zwischen Laboratorien bewertet wurden 53 . Auch das Fehlen eines theoretischen Verständnisses der dynamischen Prozesse der PCR, insbesondere im Hinblick auf die Amplifikation von nicht reproduzierbaren und/oder unerwarteten Amplifikationsprodukten, wurde bereits vor Jahrzehnten hervorgehoben 54 . Diese Beobachtungen und die daraus resultierenden Implikationen werden weitgehend vernachlässigt.
  2. qPCR und RT-qPCR waren die ersten Methoden, die eine schnelle und einfache Quantifizierung von Nukleinsäuren versprechen und weiterhin weit verbreitet sind Zitationen im Jahr 2016. Die Notwendigkeit der Optimierung des PCR-Schritts als wesentliche Bedingung, die die quantitative Natur einer PCR beeinflusst, wurde von Anfang an betont 55 , dennoch wird die qPCR immer noch als „Goldstandard“ bezeichnet 56, 57 und ist nach wie vor weit verbreitet als einfach einzurichten, anspruchslos in der Durchführung und mit leicht interpretierbaren Ergebnissen empfunden, obwohl die Einführung dieses Begriffs vor vielen Jahren in Frage gestellt wurde 58 . Tatsächlich gibt es zahlreiche kritische Fragen im Arbeitsablauf, die angegangen werden müssen, bevor biologisch aussagekräftige und vertrauenswürdige Schlussfolgerungen gezogen werden können 46, und zahlreiche Veröffentlichungen haben die wahre Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit und Konsistenz der Methode in Frage gestellt (überprüft in 13 ). Acht Jahre nach der Veröffentlichung der MIQE-Leitlinien werden jedoch in vielen Veröffentlichungen über qPCR-Daten weiterhin die grundlegendsten Informationen weggelassen, wie in Tabelle 1 gezeigt und unten erörtert.
  3. Microarrays ermöglichen einen viel höheren Durchsatz als RT-qPCR, aber aufgrund der zunehmenden Komplexität und des Zeitaufwands für die Durchführung und Analyse der Daten verliert diese Methode an Popularität, wobei eine PubMed-Suche nach dem Begriff "Microarray" im Jahr 2016 rund 1600 Zitate lieferte Wie bei der RT-qPCR gibt es Anzeichen für einen anfänglichen Mangel an Robustheit der Daten, wobei der Schwerpunkt zunächst auf der technischen Fehlerbehebung statt auf der Generierung zuverlässiger Daten von wissenschaftlicher Bedeutung 59 und klinischer Expressionssignaturen in Abhängigkeit vom jeweils angewendeten Bioinformatikprotokoll 60 lag. Die frühe plattformübergreifende Konkordanz wurde als schlecht beschrieben 61 , obwohl dies möglicherweise auf unterschiedliche Protokolle und Standards zurückzuführen ist, da die striktere Einhaltung von kontrollierten Standardarbeitsanweisungen in letzter Zeit zu einer höheren Reproduzierbarkeit innerhalb und zwischen den Labors geführt hat 62 . Auch hier überrascht es nicht, dass der Bedarf an optimierten Protokollen 63 , geeigneten Qualitätskontrollmaßnahmen 64 zusammen mit der Schaffung von Konsensrichtlinien für die Verwendung in der klinischen Diagnostik 65 betont wurde. Angesichts des Aufkommens der Shotgun-Sequenzierung des gesamten Transkriptoms oder der RNA-Seq ist es fraglich, wie lange Microarrays noch im Einsatz sein werden, aber sie stellen eine enorme potenzielle Informationsquelle dar und haben ein Erbe veröffentlichter Daten geliefert, egal wie zuverlässig oder anders sie sind vielleicht.
  4. Whole Transcriptom Shotgun Sequencing oder RNA-seq ist die technisch komplexeste, teuerste und zeitaufwendigste aller RNA-Profiling-Methoden, was die Durchführung von Replikationen oder Wiederholungsexperimenten erschwert. Ursprünglich als eine Methode beschrieben, bei der die technische Variabilität zu hoch war, um sie zu ignorieren 66 , ist immer noch unklar, wie robust und zuverlässig sie ist, obwohl ihre Verwendung zunimmt, was sich in den 2700 von PubMed im Jahr 2016 erfassten Zitaten widerspiegelt. Der Konsens ist jedoch dass RNA-seq die Vorteile einer überlegenen Sensitivität 67 und einer hohen Reproduzierbarkeit 68 bietet, zusammen mit der Fähigkeit, neue transkriptomische Merkmale mit potenziellem Einsatz in klinischen Umgebungen zu identifizieren 69 . Eine Multiplattform-Untersuchung von RNA-seq-Daten durch das Sequencing Quality Control (SEQC)-Projekt ergab, dass relative, aber nicht absolute Genexpressionsmessungen über Labors und RNA-seq-Plattformen hinweg genau und zuverlässig gemessen werden können 70 und dass RNA-seq und microarray- basierte Modelle waren in der klinischen Endpunktvorhersage vergleichbar 71 . Derzeit liegt der Schwerpunkt auf der Datenanalyse im Allgemeinen, wobei die Reproduzierbarkeit unter kontrollierten Bedingungen zwischen 60 % und 93 % liegt 72 . Die Normalisierung ist ein besonderer Aspekt, bei dem die Anwendung unterschiedlicher Methoden zu widersprüchlichen Ergebnissen führen kann 73-77 . Es gibt auch Bestrebungen, mit MIQE vergleichbare Leitlinien für jede Phase des RNA-seq-Workflows zu erstellen, um die klinische Relevanz der Daten zu gewährleisten und so zuverlässige und belastbare klinische Vorhersagen zu gewährleisten 78 . Es ist jedoch zu beachten, dass die Zuverlässigkeit vieler Sequenzierungsdaten von der Robustheit der RT- und PCR-Schritte abhängt.
  5. Zwei weitere RNA-Profiling-Methoden mit mittlerem Durchsatz sind das nCounter Analysis System von NanoString und das OpenArray System von Thermo Fisher. Ersteres hat den Vorteil, dass kein RT-Schritt erforderlich ist, letzteres den Umfang der erforderlichen Probenhandhabung. Ein Vergleich des mRNA-Abundanzprofils durch beide Technologien und RT-qPCR ergab, dass die Ergebnisse zwischen den drei Methoden weitgehend vergleichbar waren. Während die Ergebnisse von NanoString und OpenArray jedoch sehr gut korrelierten (R = 0,95) unterschieden sich die RT-qPCR-Daten signifikant von beiden (R = 0,48 mit OpenArray und R = 0,55 mit NanoString) 79 . Die Autoren führen dies auf eine erhöhte Variabilität in der Probenvorbereitung zurück, die durch den größeren Aufwand an technischem Pipettieren und Plattenaufbau für die konventionelle RT-qPCR verursacht wird. Dennoch zeigen diese Ergebnisse auch, wie widersprüchlich Ergebnisse sein können, obwohl Techniken und Analysen in geeigneter Weise durchgeführt wurden. Es lässt auch die Möglichkeit offen, dass die RT-qPCR-Ergebnisse korrekt sind und die mit den beiden anderen Methoden erhaltenen nicht. Diese Veröffentlichung ist auch ein hervorragendes Beispiel für die Menge an technischen Details, die für die zu bewertende Wissenschaft enthalten sein sollten.

Dieser kurze Überblick über die wichtigsten derzeit verwendeten RNA-Profiling-Methoden veranschaulicht die Themen, die die heftige Debatte über die Zuverlässigkeit und biologisch-klinische Relevanz vieler der mit RNA-basierten Methoden veröffentlichten Daten antreiben, und beleuchtet die vielfältigen Gründe, die der Erkenntnis zugrunde liegen, dass diese Ergebnisse sind unzuverlässig und müssen überarbeitet werden 9, 10, 16, 26, 80-87 .

Eine genaue Einschätzung des Ausmaßes und der Schwere der Nichtreproduzierbarkeit wurde durch den anekdotischen Charakter der Berichte und den Mangel an quantitativen Daten über spezifische Versäumnisse bei der Reproduktion veröffentlichter biomedizinischer Forschungen behindert. Dies führte zur Gründung des Reproduzierbarkeitsprojekts: Krebsbiologie. Ziel dieses Projekts war es, ausgewählte Ergebnisse aus der hochkarätigen präklinischen Krebsbiologieforschung zu replizieren 88 . Die ersten Ergebnisse aus fünf Studien wurden gerade veröffentlicht und zeigen, dass zwei Studien wesentliche Ergebnisse der ursprünglichen Autoren replizieren konnten, eine nicht und zwei aufgrund technischer Probleme nicht interpretierbar waren. Interessanterweise bestätigte eines der replizierten Ergebnisse 89 die selektive Herunterregulierung der MYC-Transkription durch die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) 90 der reversen Transkription (RT). Das ursprüngliche Experiment verglich die MYC-mRNA-Spiegel in Kontrollzellen und Zellen, die 1 oder 8 h mit einem niedermolekularen Inhibitor behandelt wurden, und zeigte eine Herunterregulierung in behandelten Zellen auf 6,9% und 8,8% der Kontrollzellen. In der Wiederholungsstudie wurde eine Herunterregulierung auf 14,6 % bzw. 12,6 % festgestellt, was zwar ähnlich ist, aber dennoch einen doppelten Unterschied ausmacht. Dies ist wichtig, da die von vielen Publikationen mit RT-qPCR-Daten berichteten Veränderungen der RNA-Spiegel tendenziell in diesem Bereich liegen, typischerweise zwischen dem 1,5- und dem Fünffachen.

Eine Folge des oberflächlich einfachen Ablaufs des RT-qPCR-Workflows ist, dass zum einen viele ungeschulte und ungelernte Bediener die Technik übernommen haben. Andererseits ermöglicht es einem erfahrenen Leser einer Publikation zu wissen, wo er suchen muss, um Problembereiche zu identifizieren und festzustellen, ob die berichteten Ergebnisse wahrscheinlich wahr sind. Nachfolgend finden Sie eine Zusammenfassung der methodischen Probleme, die eine konsistente Interpretation der Ergebnisse verhindern, zusammen mit expliziten Beispielen, die grafisch veranschaulichen, warum berichtete Ergebnisse so häufig unzuverlässig sind.


Wie hoch ist der Ct-Wert?

Der Zyklusschwellenwert (Ct) einer Reaktion ist definiert als die Zykluszahl, bei der die Fluoreszenz eines PCR-Produkts über dem Hintergrundsignal nachgewiesen werden kann. Um den Ct-Wert zu berechnen, ist es notwendig, eine horizontale Linie (Schwellwert) auf dem Amplifikations-Plot zu zeichnen. Die Platzierung dieser Linie wird oft von der qPCR-Software bestimmt, Benutzer können diese Linie jedoch manuell platzieren. Idealerweise wird der Schwellenwert an dem Punkt platziert, an dem sich die Reaktion in der exponentiellen Phase befindet, daher wird er nicht mit dem Hintergrundsignal verwechselt.

Wenn man sich das obige Beispiel ansieht, kann man sehen, dass die Zyklenzahl, wenn der Schwellenwert die Verstärkungskurve schneidet, 19 beträgt. Daher beträgt der Ct-Wert in diesem Fall 19.

Der Ct-Wert hängt mit der Menge des PCR-Produkts in der Reaktion zusammen. Je niedriger der Ct-Wert, desto mehr PCR-Produkt ist vorhanden. Dies liegt daran, dass weniger PCR-Zyklen benötigt werden, um dieses Produkt über dem Hintergrundsignal nachzuweisen.


Einige qPCR-Fragen (auch naive). - erste Fallstricke etc. (17. November 2005)

hi, ich verwende das takara sybrgreen extaq kit auf einem mj opticon2 cycler.
Ich habe versucht, meine ersten qPCR-Experimente einzurichten und bin auf einige Fragen / Probleme gestoßen, ich hoffe, jemand kann mir helfen.

1. Zur Bestimmung der relativen Genexpression verwende ich die PFAFFL-Methode.
wenn ich das Verhältnis zwischen zwei Stichproben in einer meiner Stichproben bestimmen möchte
die Kurve wird nie hochkommen. das heißt, ich werde nie in der Lage sein, einen Faktor zu bestimmen, oder sollte ich
Setzen Sie einfach den ct-Wert auf 50 . aber das kommt mir seltsam vor, da ich ein schwaches Band habe
wenn ich konventionelle RT-PCR mache.

2. Warum sagen die Leute, dass der Schwellenwert für das Ziel und die Referenz gleich gesetzt werden sollte?
Gen? Ich verstehe den Grund dafür nicht ganz, es sollte keinen Unterschied machen, solange die Schwelle in der linearen Phase der Verstärkung liegt, oder?

3. Ich habe große Schwankungen der ct-Werte zwischen den Assays erlebt. was kann der Hauptgrund dafür sein?

4. wenn ich meine pcr-produkte auf dem gel ausführe, erlebe ich oft eine unspezifische amplifikation in einem der dreifachen. aber was kann der Hauptgrund dafür sein? Ich habe es praktisch gleichzeitig pipettiert. könnten es die Primer oder die Matrize selbst sein (vielleicht teilweise abgebaut).

5. Ich habe in beiden Fällen zusätzliche Peaks in den Schmelzkurven festgestellt, wenn das Template zu konzentriert oder zu verdünnt ist, dies passiert jedoch nie mit den von mir verwendeten hprt1-Primern, die entweder ein schönes oder kein Signal geben .

6. Muss ich eine neue Standardkurve für die Effizienzberechnung erstellen, wenn ich die Temperschritttemperatur der Reaktion erhöhe, um das Signal spezifischer zu machen?

7. wie kann die effizienz einer pcr-reaktion mehr als 2. sie kann nicht mehr als das Doppelte tun, richtig?
vielleicht hat jemand eine schöne erklärung dafür.

8. Wie bewahrt man Ihre verdünnte cDNA am besten auf? Ich habe dh20 und 4 Grad verwendet, was vielleicht nicht das Beste ist.

viele Fragen, sorry, aber vielleicht hat jemand die Zeit, mir ein paar Antworten zu geben.

hallo hat keiner wirklich eine antwort auf mindestens eine der fragen?
. kann nicht möglich sein, oder?

Ich wäre wirklich dankbar für ein paar Antworten !
Danke schön,
Martin

Gut
Ich beschäftige mich nicht regelmäßig mit QPCR, daher werde ich versuchen, die Fragen richtig zu beantworten.

QPCR basiert auf dem Vergleich zwischen zwei Bedingungen (Referenz und Ziel). Es ist also ein schwieriger Punkt, einen guten Vergleichstest aufzustellen.

Wurden diese Assays am selben Tag durchgeführt? (Ich meine zwei Assays mit derselben Basisprobe oder haben Sie diese Assays an verschiedenen Tagen durchgeführt?)

Wenn Sie praktisch gleichzeitig sagen, meinen Sie, dass Sie eine dreigeteilte Mischung erstellt haben? oder hast du dreimal pipettiert? im letzten Fall eine Änderung der Glycerin-Endkonz. (während des Pipettierens des Enzyms) kann die allgemeine Spezifität beeinträchtigen. Aber es ist ziemlich überraschend.

Wenn ich diesen Punkt gut verstehe, meinen Sie, dass ein mlecule nach einem Zyklus zu mehr als 2 Molekülen führen kann. Soweit ich weiß ist das theoretisch unmöglich. Und normalerweise ist es nahe 1,8

Ich habe meine cDNA nicht gespeichert. Aber wenn ich müsste, würde ich sagen, dass -20 besser ist als 4°.

hoffe das klärt ein wenig.
fred

wie kann die effizienz einer pcr-reaktion mehr als 2 betragen. sie kann nicht mehr als das Doppelte tun, oder?
vielleicht hat jemand eine schöne erklärung dafür.

Klingt, als hätten Sie ein Problem mit Ihrer Pipettiertechnik. Effizienz sollte sein

1. dies basiert auf der Standardkurve. Ich vermute, dass Sie im Vergleich zu der Menge, die Sie für jede Probe eingegeben haben, zu viel cDNA in die Standards eingegeben haben. dh für die 1/10-Probe haben Sie tatsächlich 1/6 eingegeben. Dies würde die Steigung Ihrer Standardkurve ändern, auf der die Effizienz basiert.

ich habe große interassay-variationen der ct-Werte erlebt. was kann der Hauptgrund dafür sein?

Dinge ändern sich. die Menge an Primern kann leicht unterschiedlich sein, die Menge an cDNA kann leicht unterschiedlich sein. Schläuche könnten ein wenig staubig oder ölig sein oder wer weiß was. Versuchen Sie, die Dinge bei jedem Durchlauf genau gleich zu halten. dies sollte die Variation begrenzen.

Was ist der beste Weg, um Ihre verdünnte cDNA aufzubewahren? Ich habe dh20 und 4 Grad verwendet, was vielleicht nicht das Beste ist.
-20`C. in Aliquots geben und einfrieren. it'll go off otherwise.

will i have to make a new standard curve for efficiency calculation when i am increasing the annealing step temp of the reaction, to make the signal more specific?

fred was right, just reitterating it all for ya.

I am fairly new at qPCR, but I have the same problem, with excessively high efficiencies. I just watched a webcast ("How Reliable is Your qPCR Data?" presented by Drug Discovery and Development) in which that exact question was addressed.

The experts on the panel said that high efficiencies happen when the amount of template in your reaction is very low, resulting in high Ct's - so that at your high dilutions, the Ct's get "scrunched". They called this problem "saturation", but I don't understand exactly what they mean by that. does anyone else?

Anyway, they said that you need to throw out the "scrunched" Ct values at the end and only use the lower values to generate your efficiency curve.

(I tried to post the link to the on-demand webcast, but it would not show the whole link in the preview. ! Sorry.)

Es kann nicht sein. If you get it higher then 2 that means something is wrong with assay. Too much or too little template (optimize nucleic acid extraction and RT), Pipeting error (calibrate, lerger volumes), also they recommend to omit inhibited dilusions in validation test, in other word remove outliers.

Sorry I don't get the question "curve will never come up" .
7. how can the efficiency of a pcr reaction be more than 2. it can't do more than double right?
maybe someone has a nice explaination for this.

Es kann nicht sein. If you get it higher then 2 that means something is wrong with assay. Too much or too little template (optimize nucleic acid extraction and RT), Pipeting error (calibrate, lerger volumes), also they recommend to omit inhibited dilusions in validation test, in other word remove outliers.

hi thanks for your replies

with the curve will never come up, i mean that there is . soo little template?? that the curve will never cross the treshold line. if that happens, you set the ct to 50 or higher (i.e. such a high treshold would indicate that there is nothing in there. ) for calculations.

i don"t think that there is something wrong with the assay, if the efficiency gets higher than 2.
check this paper for reference:
pfaffl paper

Pfaffl paper link doesn't work. Maybe if elongation is too long or too much primers or template polymerase can copy more then once. Any way assay needs optimisation.

If there is no proper curve then any quantification would be impossible. Even when Ct values are above 35 quantification gets very dificult, becouse of efficiency problems.


Danksagung

This study was supported by Fondazione Italiana per la Lotta al Neuroblastoma, Ministero dell'Università, Ricerca Scientifica e Tecnologica, and Ministero della Salute/Regione Liguria (project: "Identification of tumor biomarkers through a biology-driven integrated approach"). Authors are grateful to Federica Del Grosso (Translational Paediatric Oncology, IST, Genoa, Italy) for cell cultures and Silvia De Luca (Fondazione Italiana per la Lotta al Neuroblastoma, Genoa, Italy) for language revision. A special thank to Giorgio Canessa, Caterina Cremonesi and Carlo Costa (Eppendorf Italia, Milan, Italy) for technical assistance.


RNA-seq

In comparison to microarrays, RNA-sequencing (or RNA-seq for short) enables you to look at differential expressions at a much broader dynamic range, to examine DNA variations (SNPs, insertions, deletions) and even discover new genes or alternative splice variations using just one dataset. Bear in mind that RNA-seq is still more expensive than microarrays and presents a bigger challenge in the planning stage though.

Firstly, you’ll have to decide which technology to use (Illumina, Solid, IonTorrent, PacBio etc – or a combination of these), what kind of library preparation to go for (strand-specific or not, barcode or not, amplified by PCR or not, remove rRNA or use oligoT beads) and what kind of sequencing you want (read length, single or paired end). And it does not stop there – you have to decide how many reads you want to sequence. Is 100x transcriptome coverage enough? It may not be if you want to analyze weakly expressed genes.

When you finally get the data, you will have to decide how to analyze it – there are already some good practices available (Tuxedo protocol for RNA-seq and GATK for SNP calling), but since the so-called “wet lab” advanced rapidly the pipelines quickly become obsolete, slow, or just don’t work anymore.

Want to perform RNA-seq bioinformatics yourself and do not want to pay a pile of money for software suites such as CLC Genomics? Then prepare to say goodbye to nice graphical interfaces. It is all Linux-based software and scripts come in different programming languages, diverse file formats that will require more than a single tool to comprehend for complete analysis. Even when all you wish to obtain are fold-changes from a single RNA-seq, you’ll have to choose from many software options that each claim to perform best for each of the standard 5 steps (adapter trimming, filtering, alignment/mapping, counting, normalization and statistical analysis) – see the list of short read alignment programs. Based on the decisions you make, the fold changes and the number of DE genes will differ accordingly.

Hiring a bioinformatician or a statistician translates to more costs in addition to library prep and sequencing expenses. Also, consider that the files you get out of the sequencers are massive (few GB per sample), so be sure to check if you need more space and computing power.

RNA-seq makes sense if you want to find DE genes in a huge, non-sequenced genome. If you are working with small genomes like bacteria for example, sequence its genome first! Lack of a reference genome means you will have to assemble the transcriptome “de-novo”, for which you will need a lot of RAM and some serious computing power if you do not want to wait for ages.

Again, you will have at least 5 of “the best” programs or pipelines to do it. This means you can get several versions of the transcriptome assembly from which you have to choose the best reference. Some guidelines to assess transcriptome assembly quality already exist, but may not hold true for all organisms and datasets so be cautious. The problem is that no parameter really guarantees that the transcripts you are interested in are really assembled correctly. For proper interpretation of RNA-seq results, transcriptome assemblies lack the confidence you get with a good quality reference sequence. Although RNA-seq is an invaluable tool to study gene expression and variation, make sure you carefully plan your experiments and estimate the costs before diving into it.

Is there an off-the-bat answer to which assay you should choose for your next gene expression experiment?

Most likely not. But there are a couple of simple questions you can answer that will help steer you in the right direction, like “How many genes am I analyzing?” oder “What is my experiment budget?” oder auch “Am I properly trained to carry out this assay?” Answer as many of these questions and come back to this guide to find your ideal pick!


Schau das Video: Quantitative real time PCR qPCR (Dezember 2021).