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9.3: Antibiotika - Biologie


Lernziele

  • Beschreiben Sie die Wirkmechanismen von Arzneimitteln, die die Zellwandbiosynthese, Proteinsynthese, Membranfunktion, Nukleinsäuresynthese und den Stoffwechselweg hemmen.

Eine wichtige Eigenschaft eines antimikrobiellen Arzneimittels ist die selektive Toxizität, was bedeutet, dass es mikrobielle Ziele selektiv abtötet oder deren Wachstum hemmt, während es dem Wirt nur minimalen oder keinen Schaden zufügt. Die meisten derzeit in der klinischen Anwendung befindlichen antimikrobiellen Arzneimittel sind antibakteriell, da die prokaryontische Zelle im Vergleich zu Pilzen, Parasiten und Viren eine größere Vielfalt an einzigartigen Zielen für selektive Toxizität bereitstellt. Jede Klasse von antibakteriellen Arzneimitteln hat einen einzigartigen Wirkmechanismus (die Art und Weise, wie ein Arzneimittel Mikroben auf zellulärer Ebene beeinflusst). Diese sind in Abbildung (PageIndex{1}) und Tabelle (PageIndex{1} zusammengefasst. ).

Tabelle (PageIndex{1}): Häufige antibakterielle Medikamente nach Wirkungsweise
WirkungsweiseZielWirkstoffklasse
Zellwandbiosynthese hemmenPenicillin-bindende Proteineβ-Lactame: Penicilline, Cephalosporine, Monobactame, Carbapeneme
Peptidoglycan-UntereinheitenGlykopeptide
Transport von Peptidoglycan-UntereinheitenBacitracin
Biosynthese von Proteinen hemmen30S ribosomale UntereinheitAminoglykoside, Tetracycline
50S ribosomale UntereinheitMakrolide, Lincosamide, Chloramphenicol, Oxazolidinone
Membranen aufbrechenLipopolysaccharid, innere und äußere MembranenPolymyxin B, Colistin, Daptomycin
Nukleinsäuresynthese hemmenRNARifamycin
DNAFluorchinolone
AntimetabolitenEnzym zur FolsäuresyntheseSulfonamide, Trimethoprim
Enzym zur Synthese von MykolsäureIsonicotinsäurehydrazid
Mykobakterieller Adenosintriphosphat (ATP)-Synthase-HemmerMykobakterielle ATP-SynthaseDiarylchinolin

Inhibitoren der Zellwandbiosynthese

Mehrere verschiedene Klassen von Antibiotika blockieren Schritte in der Biosynthese von Peptidoglycan, wodurch Zellen anfälliger für osmotische Lyse werden (Tabelle (PageIndex{2})). Daher sind antibakterielle Mittel, die auf die Zellwandbiosynthese abzielen, in ihrer Wirkung bakterizid. Da menschliche Zellen kein Peptidoglycan herstellen, ist diese Wirkungsweise ein hervorragendes Beispiel für selektive Toxizität.

Penicillin, das erste entdeckte Antibiotikum, ist eines von mehreren Antibiotika innerhalb einer Klasse namens β-Lactame. Diese Gruppe von Verbindungen umfasst die Penicilline, Cephalosporine, Monobactame und Carbapeneme und ist durch das Vorhandensein eines β-Lactamrings gekennzeichnet, der sich in der zentralen Struktur des Wirkstoffmoleküls befindet (Abbildung (PageIndex{2})). Die β-Lactam-Antibiotika blockieren die Vernetzung von Peptidketten während der Biosynthese von neuem Peptidoglykan in der Bakterienzellwand. Sie sind in der Lage, diesen Prozess zu blockieren, da die β-Lactam-Struktur der Struktur der Peptidoglycan-Untereinheitskomponente ähnelt, die von dem quervernetzenden Transpeptidase-Enzym, auch bekannt als Penicillin-bindendes Protein (PBP), erkannt wird. Obwohl der β-Lactam-Ring unverändert bleiben muss, damit diese Medikamente ihre antibakterielle Aktivität beibehalten, haben strategische chemische Veränderungen an den R-Gruppen die Entwicklung einer Vielzahl halbsynthetischer β-Lactam-Medikamente mit erhöhter Wirksamkeit, erweitertem Wirkungsspektrum und längerer Zeit ermöglicht Halbwertszeiten für eine bessere Dosierung, unter anderem.

Penicillin G und Penicillin V sind natürliche Antibiotika aus Pilzen und wirken vor allem gegen grampositive bakterielle Krankheitserreger und einige wenige gramnegative bakterielle Krankheitserreger wie z Pasteurella multocida. Abbildung (PageIndex{2}) fasst die halbsynthetische Entwicklung einiger Penicilline zusammen. Hinzufügen einer Aminogruppe (-NH2) zu Penicillin G schufen die Aminopenicilline (d. h. Ampicillin und Amoxicillin), die ein erhöhtes Aktivitätsspektrum gegen mehr gramnegative Pathogene aufweisen. Darüber hinaus erhöhte die Zugabe einer Hydroxylgruppe (-OH) zu Amoxicillin die Säurestabilität, was eine verbesserte orale Absorption ermöglicht. Methicillin ist ein halbsynthetisches Penicillin, das entwickelt wurde, um die Ausbreitung von Enzymen (Penicillinasen) zu bekämpfen, die die anderen Penicilline inaktivieren. Die Änderung der R-Gruppe von Penicillin G durch die sperrigere Dimethoxyphenylgruppe bot einen Schutz des β-Lactamrings vor enzymatischer Zerstörung durch Penicillinasen, was uns das erste Penicillinase-resistente Penicillin lieferte.

Cephalosporine enthalten ähnlich den Penicillinen einen β-Lactam-Ring (Abbildung (PageIndex{2})) und blockieren die Transpeptidase-Aktivität von Penicillin-bindenden Proteinen. Allerdings ist der β-Lactam-Ring von Cephalosporinen mit einem sechsgliedrigen Ring kondensiert, anstatt mit dem fünfgliedrigen Ring, der in Penicillinen gefunden wird. Dieser chemische Unterschied verleiht Cephalosporinen eine erhöhte Resistenz gegenüber enzymatischer Inaktivierung durch β-Lactamasen. Der Wirkstoff Cephalosporin C wurde ursprünglich aus dem Pilz isoliert Cephalosporium acremonium in den 1950er Jahren und hat ein ähnliches Wirkungsspektrum wie Penicillin gegen grampositive Bakterien, ist jedoch gegen mehr gramnegative Bakterien aktiv als Penicillin. Ein weiterer wichtiger struktureller Unterschied besteht darin, dass Cephalosporin C zwei R-Gruppen besitzt, verglichen mit nur einer R-Gruppe für Penicillin, und dies sorgt für eine größere Vielfalt bei den chemischen Veränderungen und der Entwicklung halbsynthetischer Cephalosporine. Die Familie der halbsynthetischen Cephalosporine ist viel größer als die der Penicilline, und diese Medikamente wurden hauptsächlich aufgrund ihres Wirkungsspektrums in Generationen eingeteilt, wobei das Spektrum von den Schmalspektrum-Cephalosporinen der ersten Generation zu den Breitspektrum-Cephalosporinen der vierten Generation zunimmt Cephalosporine. Es wurde ein neues Cephalosporin der fünften Generation entwickelt, das gegen Methicillin-resistente wirksam ist Staphylococcus aureus (MRSA).

Die Carbapeneme und Monobactame besitzen ebenfalls einen β-Lactam-Ring als Teil ihrer Kernstruktur und hemmen die Transpeptidase-Aktivität von Penicillin-bindenden Proteinen. Das einzige klinisch verwendete Monobactam ist Aztreonam. Es ist ein Schmalspektrum-Antibiotikum mit Wirkung nur gegen gramnegative Bakterien. Im Gegensatz dazu umfasst die Familie der Carbapeneme eine Vielzahl halbsynthetischer Medikamente (Imipenem, Meropenem und Doripenem), die ein sehr breites Wirkungsspektrum gegen grampositive und gramnegative bakterielle Pathogene aufweisen.

Das Medikament Vancomycin, ein Mitglied einer Klasse von Verbindungen, die Glykopeptide genannt werden, wurde in den 1950er Jahren als natürliches Antibiotikum aus den Aktinomyceten entdeckt Amycolatopsis orientalis. Vancomycin hemmt ähnlich wie die β-Lactame die Zellwandbiosynthese und wirkt bakterizid. Im Gegensatz zu den β-Lactamen ähnelt die Struktur von Vancomycin jedoch nicht der von Zellwand-Peptidoglycan-Untereinheiten und inaktiviert Penicillin-bindende Proteine ​​nicht direkt. Vancomycin ist vielmehr ein sehr großes, komplexes Molekül, das an das Ende der Peptidkette von Zellwandvorläufern bindet und eine strukturelle Blockade erzeugt, die den Einbau der Zellwanduntereinheiten in das wachsende N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure (NAM .) verhindert -NAG) Rückgrat der Peptidoglycan-Struktur (Transglycosylierung). Vancomycin blockiert auch strukturell die Transpeptidierung. Vancomycin ist bakterizid gegen grampositive bakterielle Krankheitserreger, jedoch nicht wirksam gegen gramnegative Bakterien, da es die schützende äußere Membran nicht durchdringen kann.

Das Medikament Bacitracin besteht aus einer Gruppe strukturell ähnlicher Peptidantibiotika, die ursprünglich aus Bacillus subtilis. Bacitracin blockiert die Aktivität eines spezifischen Zellmembranmoleküls, das für die Bewegung von Peptidoglycan-Vorläufern aus dem Zytoplasma zum Äußeren der Zelle verantwortlich ist, und verhindert letztendlich ihren Einbau in die Zellwand. Bacitracin ist gegen eine Vielzahl von Bakterien wirksam, einschließlich grampositiver Organismen, die auf der Haut vorkommen, wie z Staphylokokken und Streptokokken. Obwohl Bacitracin unter bestimmten Umständen oral oder intramuskulär verabreicht werden kann, hat es sich als nephrotoxisch (nierenschädigend) erwiesen. Daher wird es häufiger mit Neomycin und Polymyxin in topischen Salben wie Neosporin kombiniert.

Tabelle (PageIndex{2}): Medikamente, die die bakterielle Zellwandsynthese hemmen
WirkmechanismusWirkstoffklasseSpezifische MedikamenteNatürlich oder halbsynthetischAktivitätsspektrum
Interagieren Sie direkt mit PBPs und hemmen Sie die Transpeptidase-AktivitätPenicillinePenicillin G, Penicillin VNatürlichSchmalspektrum gegen grampositive und wenige gramnegative Bakterien
Ampicillin, AmoxicillinHalbsynthetischSchmalspektrum gegen grampositive Bakterien aber mit erhöhtem gramnegativem Spektrum
MethicillinHalbsynthetischSchmalspektrum nur gegen grampositive Bakterien, einschließlich Stämme, die Penicillinase produzieren
CephalosporineCephalosporin CNatürlichSchmalspektrum ähnlich wie Penicillin, aber mit erhöhtem gramnegativem Spektrum
Cephalosporine der ersten GenerationHalbsynthetischSchmalspektrum ähnlich wie Cephalosporin C
Cephalosporine der zweiten GenerationHalbsynthetischSchmalspektrum, aber mit erhöhtem Gram-Negativ-Spektrum im Vergleich zur ersten Generation
Cephalosporine der dritten und vierten GenerationHalbsynthetischBreites Spektrum gegen grampositive und gramnegative Bakterien, einschließlich einiger β-Lactamase-Produzenten
Cephalosporine der fünften GenerationHalbsynthetischBreites Spektrum gegen grampositive und gramnegative Bakterien, einschließlich MRSA
MonobactameAztreonamHalbsynthetischSchmalspektrum gegen gramnegative Bakterien, einschließlich einiger β-Lactamase-Produzenten
CarbapenemeImipenem, Meropenem, DoripenemHalbsynthetischBreitestes Spektrum der β-Lactame gegen grampositive und gramnegative Bakterien, darunter viele β-Lactamase-Produzenten
Große Moleküle, die an die Peptidkette von Peptidoglycan-Untereinheiten binden und die Transglycosylierung und Transpeptidierung blockierenGlykopeptideVancomycinNatürlichSchmales Spektrum nur gegen grampositive Bakterien, einschließlich multiresistenter Stämme
Blockieren Sie den Transport von Peptidoglycan-Untereinheiten durch die zytoplasmatische MembranBacitracinBacitracinNatürlichBreitband gegen grampositive und gramnegative Bakterien

Übung (PageIndex{1})

Beschreiben Sie die Wirkungsweise von β-Lactamen.

Inhibitoren der Proteinbiosynthese

Die zytoplasmatischen Ribosomen in Tierzellen (80S) unterscheiden sich strukturell von denen in Bakterienzellen (70S), was die Proteinbiosynthese zu einem guten selektiven Ziel für antibakterielle Medikamente macht. In diesem Abschnitt werden verschiedene Arten von Proteinbiosynthese-Inhibitoren diskutiert und in Abbildung (PageIndex{3}) zusammengefasst.

Proteinsynthese-Inhibitoren, die die 30S-Untereinheit binden

Aminoglykoside sind große, hochpolare antibakterielle Wirkstoffe, die an die 30S-Untereinheit bakterieller Ribosomen binden und die Korrekturfähigkeit des ribosomalen Komplexes beeinträchtigen. Diese Beeinträchtigung verursacht Fehlpaarungen zwischen Codons und Anticodons, was zur Produktion von Proteinen mit falschen Aminosäuren und verkürzten Proteinen führt, die in die zytoplasmatische Membran inserieren. Die Zerstörung der Zytoplasmamembran durch die fehlerhaften Proteine ​​tötet die Bakterienzellen ab. Die Aminoglykoside, zu denen Medikamente wie Streptomycin, Gentamicin, Neomycin und Kanamycin gehören, sind wirksame Breitbandantibiotika. Aminoglykoside haben sich jedoch als nephrotoxisch (schädigend für die Nieren), neurotoxisch (schädigend für das Nervensystem) und ototoxisch (schädigend für das Ohr) erwiesen.

Eine weitere Klasse antibakterieller Verbindungen, die an die 30S-Untereinheit binden, sind die Tetracycline. Im Gegensatz zu Aminoglykosiden sind diese Medikamente bakteriostatisch und hemmen die Proteinsynthese, indem sie die Assoziation von tRNAs mit dem Ribosom während der Translation blockieren. Natürlich vorkommende Tetracycline, die von verschiedenen Stämmen von produziert werden Streptomyces wurden erstmals in den 1940er Jahren entdeckt, und mehrere halbsynthetische Tetracycline, darunter Doxycyclin und Tigecyclin, wurden ebenfalls hergestellt. Obwohl die Tetracycline ein breites Spektrum an bakteriellen Krankheitserregern abdecken, können Nebenwirkungen, die ihre Anwendung einschränken können, Phototoxizität, bleibende Verfärbung der sich entwickelnden Zähne und Lebertoxizität bei hohen Dosen oder bei Patienten mit eingeschränkter Nierenfunktion sein.

Proteinsynthese-Inhibitoren, die die 50S-Untereinheit binden

Es gibt mehrere Klassen antibakterieller Wirkstoffe, die durch Bindung an die 50S-Untereinheit bakterieller Ribosomen wirken. Die antibakteriellen Makrolid-Wirkstoffe haben eine große, komplexe Ringstruktur und sind Teil einer größeren Klasse von natürlich produzierten Sekundärmetaboliten, die Polyketide genannt werden, komplexe Verbindungen, die schrittweise durch die wiederholte Addition von Zwei-Kohlenstoff-Einheiten nach einem ähnlichen Mechanismus wie für Fettsäuresynthese. Makrolide sind bakteriostatische Breitbandwirkstoffe, die die Verlängerung von Proteinen blockieren, indem sie die Bildung von Peptidbindungen zwischen bestimmten Aminosäurekombinationen hemmen. Das erste Makrolid war Erythromycin. Es wurde 1952 von isoliert Streptomyces erythreus und verhindert eine Translokation. Halbsynthetische Makrolide umfassen Azithromycin und Telithromycin. Im Vergleich zu Erythromycin hat Azithromycin ein breiteres Wirkungsspektrum, weniger Nebenwirkungen und eine signifikant längere Halbwertszeit (1,5 Stunden für Erythromycin gegenüber 68 Stunden für Azithromycin), was eine einmal tägliche Dosierung und eine kurze 3-tägige Therapie ermöglicht (dh Zpac-Formulierung) für die meisten Infektionen. Telithromycin ist das erste Halbsynthetische innerhalb der Klasse der Ketolide. Obwohl Telithromycin eine erhöhte Wirksamkeit und Aktivität gegen Makrolid-resistente Krankheitserreger zeigt, hat die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) seine Anwendung auf die Behandlung von ambulant erworbener Pneumonie beschränkt und verlangt wegen der schweren Hepatotoxizität die stärkste „Black-Box-Warnung“ für das Medikament .

Die Lincosamide umfassen das natürlich produzierte Lincomycin und das halbsynthetische Clindamycin. Obwohl sie sich strukturell von Makroliden unterscheiden, ähneln Lincosamide in ihrer Wirkungsweise den Makroliden, da sie an die ribosomale 50S-Untereinheit binden und die Bildung von Peptidbindungen verhindern. Lincosamide sind besonders wirksam gegen Streptokokken- und Staphylokokkeninfektionen.

Das Medikament Chloramphenicol stellt eine weitere strukturell unterschiedliche Klasse von Antibiotika dar, die auch an das 50S-Ribosom binden und die Bildung von Peptidbindungen hemmen. Chloramphenicol, hergestellt von Streptomyces venezuelae, wurde 1947 entdeckt; 1949 wurde es das erste Breitbandantibiotikum, das von der FDA zugelassen wurde. Obwohl es ein natürliches Antibiotikum ist, lässt es sich auch leicht synthetisieren und war das erste antibakterielle Medikament, das synthetisch in Massenproduktion hergestellt wurde. Aufgrund seiner Massenproduktion, seines breiten Spektrums und seiner Fähigkeit, effizient in Gewebe einzudringen, wurde Chloramphenicol in der Vergangenheit zur Behandlung einer Vielzahl von Infektionen eingesetzt, von Meningitis über Typhus bis hin zu Konjunktivitis. Leider haben schwerwiegende Nebenwirkungen wie das tödliche Grey-Baby-Syndrom und die Unterdrückung der Knochenmarkproduktion seine klinische Rolle eingeschränkt. Chloramphenicol verursacht auch auf zwei verschiedene Arten Anämie. Ein Mechanismus beinhaltet das Targeting von mitochondrialen Ribosomen innerhalb hämatopoetischer Stammzellen, was zu einer reversiblen, dosisabhängigen Unterdrückung der Blutzellproduktion führt. Nach Beendigung der Chloramphenicol-Dosierung normalisiert sich die Blutzellenproduktion. Dieser Mechanismus unterstreicht die Ähnlichkeit zwischen 70S-Ribosomen von Bakterien und den 70S-Ribosomen in unseren Mitochondrien. Der zweite Mechanismus der Anämie ist idiosynkratisch (d. h. der Mechanismus ist nicht verstanden) und beinhaltet einen irreversiblen tödlichen Verlust der Blutzellenproduktion, der als aplastische Anämie bekannt ist. Dieser Mechanismus der aplastischen Anämie ist nicht dosisabhängig und kann sich nach Beendigung der Therapie entwickeln. Aufgrund von Toxizitätsproblemen ist die Verwendung von Chloramphenicol beim Menschen in den Vereinigten Staaten heute selten und auf schwere Infektionen beschränkt, die nicht mit weniger toxischen Antibiotika behandelt werden können. Da seine Nebenwirkungen bei Tieren viel weniger schwerwiegend sind, wird es in der Veterinärmedizin verwendet.

Die Oxazolidinone, einschließlich Linezolid, sind eine neue Breitbandklasse synthetischer Proteinsynthesehemmer, die an die ribosomale 50S-Untereinheit von grampositiven und gramnegativen Bakterien binden. Ihr Wirkmechanismus scheint sich jedoch etwas von dem der anderen bereits diskutierten Inhibitoren der 50S-Untereinheit-bindenden Proteinsynthese zu unterscheiden. Stattdessen scheinen sie die Bildung des Initiationskomplexes (Assoziation der 50S-Untereinheit, 30S-Untereinheit und anderer Faktoren) für die Translation zu stören, und sie verhindern die Translokation des wachsenden Proteins von der ribosomalen A-Stelle zur P-Stelle. Tabelle (PageIndex{3}) fasst die Proteinsynthese-Inhibitoren zusammen.

Tabelle (PageIndex{3}): Medikamente, die die bakterielle Proteinsynthese hemmen
Molekulares ZielWirkmechanismusWirkstoffklasseSpezifische MedikamenteBakteriostatisch oder bakterizidAktivitätsspektrum
30S-UntereinheitVerursacht Fehlpaarungen zwischen Codons und Anticodons, was zu fehlerhaften Proteinen führt, die sich in die zytoplasmatische Membran einfügen und diese zerstörenAminoglykosideStreptomycin, Gentamicin, Neomycin, KanamycinBakterizidBreites Spektrum
Blockiert die Assoziation von tRNAs mit RibosomenTetracyclineTetracyclin, Doxycyclin, TigecyclinBakterienhemmendBreites Spektrum
50S-UntereinheitBlockiert die Bildung von Peptidbindungen zwischen AminosäurenMakrolideErythromycin, Azithromycin, TelithromycinBakterienhemmendBreites Spektrum
LincosamideLincomycin, ClindamycinBakterienhemmendSchmales Spektrum
UnzutreffendChloramphenicolBakterienhemmendBreites Spektrum
Beeinträchtigt die Bildung des Initiationskomplexes zwischen 50S- und 30S-Untereinheiten und anderen Faktoren.OxazolidinoneLinezolidBakterienhemmendBreites Spektrum

Übung (PageIndex{2})

Vergleichen und kontrastieren Sie die verschiedenen Arten von Proteinsynthesehemmern.

Inhibitoren der Membranfunktion

Eine kleine Gruppe von Antibiotika zielt als Wirkmechanismus auf die Bakterienmembran ab (Tabelle (PageIndex{4})). Die Polymyxine sind natürliche Polypeptidantibiotika, die erstmals 1947 als Produkte von . entdeckt wurden Bacillus polymyxa; nur Polymyxin B und Polymyxin E (Colistin) wurden klinisch verwendet. Sie sind lipophil mit detergensähnlichen Eigenschaften und interagieren mit der Lipopolysaccharidkomponente der äußeren Membran gramnegativer Bakterien, wodurch letztendlich sowohl ihre äußere als auch ihre innere Membran zerstört und die Bakterienzellen abgetötet werden. Leider ist der Membran-Targeting-Mechanismus keine selektive Toxizität, und diese Medikamente zielen auch auf die Membran von Zellen in der Niere und im Nervensystem ab und schädigen sie, wenn sie systemisch verabreicht werden.Aufgrund dieser schwerwiegenden Nebenwirkungen und ihrer schlechten Absorption aus dem Verdauungstrakt wird Polymyxin B in rezeptfreien topischen antibiotischen Salben (z Mikroben bei immungeschwächten Patienten oder bei Patienten, die sich bestimmten Bauchoperationen unterziehen. Das Auftreten und die Verbreitung multiresistenter Krankheitserreger hat jedoch dazu geführt, dass Colistin in Krankenhäusern vermehrt intravenös verabreicht wird, oft als letztes Mittel zur Behandlung schwerer Infektionen. Das antibakterielle Daptomycin ist ein zyklisches Lipopeptid, das von Streptomyces roseosporus das scheint wie die Polymyxine zu funktionieren, indem es sich in die bakterielle Zellmembran einfügt und diese zerstört. Im Gegensatz zu Polymyxin B und Colistin, die nur auf gramnegative Bakterien abzielen, zielt Daptomycin jedoch spezifisch auf grampositive Bakterien ab. Es wird typischerweise intravenös verabreicht und scheint gut verträglich zu sein und zeigt eine reversible Toxizität in der Skelettmuskulatur.

Tabelle (PageIndex{4}): Medikamente, die die Funktion der Bakterienmembran hemmen
WirkmechanismusWirkstoffklasseSpezifische MedikamenteAktivitätsspektrumKlinische Anwendung
Interagiert mit Lipopolysaccharid in der äußeren Membran gramnegativer Bakterien und tötet die Zelle durch die eventuelle Zerstörung der äußeren Membran und der zytoplasmatischen MembranPolymyxinePolymyxin BSchmales Spektrum gegen gramnegative Bakterien, einschließlich multiresistenter StämmeTopische Präparate zur Vorbeugung von Infektionen in Wunden
Polymyxin E (Colistin)Schmales Spektrum gegen gramnegative Bakterien, einschließlich multiresistenter StämmeOrale Dosierung zur Dekontamination des Darms zur Vorbeugung von Infektionen bei immungeschwächten Patienten oder Patienten, die sich einer invasiven Operation/einem invasiven Verfahren unterziehen.
Intravenöse Dosierung zur Behandlung schwerer systemischer Infektionen durch multiresistente Erreger
Setzt sich in die zytoplasmatische Membran grampositiver Bakterien ein, zerstört die Membran und tötet die ZelleLipopeptidDaptomycinSchmales Spektrum gegen grampositive Bakterien, einschließlich multiresistenter StämmeKomplizierte Infektionen der Haut und der Hautstruktur sowie Bakteriämie durch grampositive Erreger, einschließlich MRSA

Übung (PageIndex{3})

Wie hemmen Polymyxine die Membranfunktion?

Inhibitoren der Nukleinsäuresynthese

Einige antibakterielle Medikamente wirken, indem sie die Nukleinsäuresynthese hemmen (Tabelle (PageIndex{5})). Metronidazol ist beispielsweise ein halbsynthetisches Mitglied der Nitroimidazol-Familie, das auch ein Antiprotozoon ist. Es stört die DNA-Replikation in Zielzellen. Das Medikament Rifampin ist ein halbsynthetisches Mitglied der Rifamycin-Familie und wirkt, indem es die RNA-Polymerase-Aktivität in Bakterien blockiert. Die RNA-Polymerase-Enzyme in Bakterien unterscheiden sich strukturell von denen in Eukaryoten und sorgen für eine selektive Toxizität gegenüber Bakterienzellen. Es wird zur Behandlung einer Vielzahl von Infektionen verwendet, aber seine Hauptanwendung, oft in einem Cocktail mit anderen antibakteriellen Medikamenten, ist gegen Mykobakterien, die Tuberkulose verursachen. Trotz der Selektivität seines Mechanismus kann Rifampin Leberenzyme induzieren, um den Metabolismus anderer verabreichter Medikamente zu erhöhen (Antagonismus), was zu Hepatotoxizität (Lebertoxizität) führt und die Bioverfügbarkeit und therapeutische Wirkung der Begleitmedikamente negativ beeinflusst.

Ein Mitglied der Chinolon-Familie, einer Gruppe synthetischer Antibiotika, ist Nalidixinsäure. Es wurde 1962 als Nebenprodukt bei der Synthese von Chloroquin, einem Antimalariamittel, entdeckt. Nalidixinsäure hemmt selektiv die Aktivität der bakteriellen DNA-Gyrase und blockiert die DNA-Replikation. Chemische Modifikationen des ursprünglichen Chinolon-Rückgrats haben zur Bildung von Fluorchinolonen wie Ciprofloxacin und Levofloxacin geführt, die ebenfalls die Aktivität der DNA-Gyrase hemmen. Ciprofloxacin und Levofloxacin sind gegen ein breites Spektrum grampositiver oder gramnegativer Bakterien wirksam und gehören zu den am häufigsten verschriebenen Antibiotika zur Behandlung einer Vielzahl von Infektionen, einschließlich Harnwegsinfektionen, Atemwegsinfektionen, Bauchinfektionen und Hautinfektionen . Trotz ihrer selektiven Toxizität gegenüber DNA-Gyrase umfassen die mit verschiedenen Fluorchinolonen verbundenen Nebenwirkungen jedoch Phototoxizität, Neurotoxizität, Kardiotoxizität, Glukosestoffwechsel-Dysfunktion und ein erhöhtes Risiko für Sehnenrupturen.

Tabelle (PageIndex{5}): Medikamente, die die bakterielle Nukleinsäuresynthese hemmen
WirkmechanismenWirkstoffklasseSpezifische MedikamenteAktivitätsspektrumKlinische Anwendung
Hemmt die Aktivität der bakteriellen RNA-Polymerase und blockiert die Transkription, wodurch die Zelle abgetötet wirdRifamycinRifampinSchmales Spektrum mit Aktivität gegen grampositive und begrenzte Anzahl gramnegativer Bakterien. Auch aktiv gegen Mycobacterium tuberculosis.Kombinationstherapie zur Behandlung von Tuberkulose
Hemmt die Aktivität der DNA-Gyrase und blockiert die DNA-Replikation, wodurch die Zelle abgetötet wirdFluorchinoloneCiprofloxacin, Ofloxacin, MoxifloxacinBreites Spektrum gegen grampositive und gramnegative BakterienGroße Vielfalt an Haut- und systemischen Infektionen

Übung (PageIndex{4})

Warum zielen Inhibitoren der bakteriellen Nukleinsäuresynthese nicht auf Wirtszellen?

Einige synthetische Medikamente kontrollieren bakterielle Infektionen, indem sie als Antimetaboliten wirken, kompetitive Inhibitoren für bakterielle Stoffwechselenzyme (Tabelle (PageIndex{6})). Die Sulfonamide (Sulfa-Medikamente) sind die ältesten synthetischen antibakteriellen Wirkstoffe und sind strukturelle Analoga von para-Aminobenzoesäure (PABA), ein frühes Zwischenprodukt der Folsäuresynthese (Abbildung (PageIndex{4})). Durch Hemmung des Enzyms, das an der Produktion von Dihydrofolsäure beteiligt ist, blockieren Sulfonamide die bakterielle Biosynthese von Folsäure und anschließend von Pyrimidinen und Purinen, die für die Nukleinsäuresynthese benötigt werden. Dieser Wirkmechanismus bewirkt eine bakteriostatische Wachstumshemmung gegen ein breites Spektrum grampositiver und gramnegativer Pathogene. Da der Mensch Folsäure aus der Nahrung aufnimmt, anstatt sie intrazellulär zu synthetisieren, sind Sulfonamide für Bakterien selektiv toxisch. Allergische Reaktionen auf Sulfonamide sind jedoch häufig. Die Sulfone sind Sulfonamiden strukturell ähnlich, werden aber heute außer zur Behandlung der Hansen-Krankheit (Lepra) nicht häufig verwendet.

Trimethoprim ist eine synthetische antimikrobielle Verbindung, die als Antimetabolit innerhalb des gleichen Folsäuresynthesewegs wie Sulfonamide dient. Trimethoprim ist jedoch ein strukturelles Analogon der Dihydrofolsäure und hemmt einen späteren Schritt im Stoffwechselweg (Abbildung (PageIndex{4})). Trimethoprim wird in Kombination mit dem Sulfa-Medikament Sulfamethoxazol zur Behandlung von Harnwegsinfektionen, Ohrenentzündungen und Bronchitis angewendet. Wie bereits erwähnt, ist die Kombination von Trimethoprim und Sulfamethoxazol ein Beispiel für eine antibakterielle Synergie. Bei alleiniger Anwendung verringert jeder Antimetabolit nur die Produktion von Folsäure auf ein Niveau, bei dem eine bakteriostatische Wachstumshemmung auftritt. Wenn sie jedoch in Kombination verwendet werden, verringert die Hemmung beider Schritte im Stoffwechselweg die Folsäuresynthese auf ein Niveau, das für die Bakterienzelle tödlich ist. Aufgrund der Bedeutung von Folsäure während der fetalen Entwicklung sollten Sulfonamide und die Anwendung von Trimethoprim während der frühen Schwangerschaft sorgfältig erwogen werden.

Das Medikament Isoniazid ist ein Antimetabolit mit spezifischer Toxizität für Mykobakterien und wird seit langem in Kombination mit Rifampin oder Streptomycin zur Behandlung von Tuberkulose eingesetzt. Es wird als Prodrug verabreicht und erfordert eine Aktivierung durch die Wirkung eines intrazellulären bakteriellen Peroxidase-Enzyms, das Isoniazid-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) und Isoniazid-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADP) bildet und letztendlich die Synthese der essentiellen Mykolsäure verhindert für mykobakterielle Zellwände. Mögliche Nebenwirkungen der Anwendung von Isoniazid sind Hepatotoxizität, Neurotoxizität und hämatologische Toxizität (Anämie).

Tabelle (PageIndex{6}): Antimetaboliten-Medikamente
Ziel des StoffwechselwegesWirkmechanismusWirkstoffklasseSpezifische MedikamenteAktivitätsspektrum
FolsäuresyntheseHemmt das Enzym, das an der Produktion von Dihydrofolsäure beteiligt istSulfonamideSulfamethoxazolBreites Spektrum gegen grampositive und gramnegative Bakterien
SulfoneDapson
Hemmt das Enzym, das an der Produktion von Tetrahydrofolsäure beteiligt istUnzutreffendTrimethoprimBreites Spektrum gegen grampositive und gramnegative Bakterien
MykolsäuresyntheseStört die Synthese von MykolsäureUnzutreffendIsoniazidSchmales Spektrum gegen Mykobakterium spp., einschließlich M. tuberkulose

Übung (PageIndex{5})

Wie zielen Sulfonamide und Trimethoprim selektiv auf Bakterien ab?

Inhibitor der ATP-Synthase

Bedaquilin, ein Vertreter der synthetischen antibakteriellen Wirkstoffklasse der Diarylchinolone, verwendet einen neuartigen Wirkmechanismus, der das Wachstum von Mykobakterien spezifisch hemmt. Obwohl der spezifische Mechanismus noch nicht aufgeklärt werden muss, scheint diese Verbindung die Funktion von ATP-Synthasen zu stören, möglicherweise durch Beeinträchtigung der Verwendung des Wasserstoffionengradienten für die ATP-Synthese durch oxidative Phosphorylierung, was zu einer verringerten ATP-Produktion führt. Aufgrund seiner Nebenwirkungen, einschließlich Hepatotoxizität und potenziell tödlicher Herzrhythmusstörungen, ist seine Anwendung schweren, ansonsten nicht behandelbaren Fällen von Tuberkulose vorbehalten.

Um mehr über die allgemeinen Prinzipien der antimikrobiellen Therapie und die Wirkungsweise von Bakterien zu erfahren, besuchen Sie die Antimicrobial Resistance Learning Site der Michigan State University, insbesondere die Seiten 6 bis 9.

Klinischer Fokus: Teil 2

Beim Lesen der Krankengeschichte von Marisa bemerkte die Ärztin, dass sie während ihres Krankenhausaufenthalts in Vietnam katheterisiert wurde und die antimikrobiellen Medikamente Ceftazidim und Metronidazol erhielt. Als er dies erfuhr, ordnete der Arzt eine CT-Untersuchung von Marisas Bauch an, um eine Blinddarmentzündung auszuschließen; der Arzt verlangte auch eine Blutuntersuchung, um zu sehen, ob sie eine erhöhte Anzahl weißer Blutkörperchen hatte, und ordnete einen Urinanalysetest und eine Urinkultur an, um nach weißen Blutkörperchen, roten Blutkörperchen und Bakterien zu suchen.

Marisas Urinprobe war positiv für das Vorhandensein von Bakterien, was auf eine Harnwegsinfektion (HWI) hindeutet. Der Arzt hat Ciprofloxacin verschrieben. In der Zwischenzeit wurde ihr Urin kultiviert, um das Bakterium für weitere Tests zu züchten.

Übung (PageIndex{6})

  1. Welche Arten von Antibiotika werden typischerweise bei Harnwegsinfektionen verschrieben?
  2. Basierend auf den antimikrobiellen Medikamenten, die ihr in Vietnam verabreicht wurden, welche der antimikrobiellen Mittel zur Behandlung einer Harnwegsinfektion würden Sie als unwirksam vorhersagen?

Schlüsselkonzepte und Zusammenfassung

  • Antibakterielle Verbindungen zeigen selektive Toxizität, hauptsächlich aufgrund von Unterschieden zwischen prokaryotischen und eukaryotischen Zellstrukturen.
  • Inhibitoren der Zellwandsynthese, einschließlich der β-Lactame, das Glykopeptide, und Bacitracin, stören die Peptidoglycan-Synthese und machen Bakterienzellen anfälliger für osmotische Lyse.
  • Es gibt eine Vielzahl von bakteriellen Breitspektrum-Proteinsynthesehemmern, die selektiv auf das prokaryontische 70S-Ribosom abzielen, einschließlich solcher, die an die 30S-Untereinheit binden (Aminoglykoside und Tetracycline) und andere, die an die 50S-Untereinheit binden (Makrolide, Lincosamide, Chloramphenicol, und Oxazolidinone).
  • Polymyxine sind lipophile Polypeptidantibiotika, die auf die Lipopolysaccharidkomponente gramnegativer Bakterien abzielen und letztendlich die Integrität der äußeren und inneren Membranen dieser Bakterien zerstören.
  • Die Nukleinsäuresynthesehemmer Rifamycine und Fluorchinolone Ziel bakterieller RNA-Transkription bzw. DNA-Replikation.
  • Einige antibakterielle Medikamente sind Antimetaboliten, die als kompetitive Inhibitoren für bakterielle Stoffwechselenzyme wirken. Sulfonamide und trimethoprim sind Antimetaboliten, die die bakterielle Folsäuresynthese stören. Isoniazid ist ein Antimetabolit, der die Mykolsäuresynthese in Mykobakterien stört.

Mitwirkender

  • Nina Parker (Shenandoah University), Mark Schneegurt (Wichita State University), Anh-Hue Thi Tu (Georgia Southwestern State University), Philip Lister (Central New Mexico Community College) und Brian M. Forster (Saint Joseph's University) mit vielen beitragende Autoren. Originalinhalt über Openstax (CC BY 4.0; Zugang kostenlos unter https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction)


Antibiotikaempfindlichkeit und molekulare Analysen klinischer Enterobacter cloacae-Isolate in der östlichen Provinz Heilongjiang, China

Hintergrund: Enterobacter cloacae ist ein aufkommender opportunistischer Erreger. Wir führten retrospektiv eine Studie zur Bewertung der antimikrobiellen Empfindlichkeit durch und untersuchten die molekularen Eigenschaften von Carbapenem-resistenten Enterobacter cloacae (CREL)-Isolaten.

Methoden: Von Januar 2014 bis Dezember 2018 wurden dreihundertzweiundvierzig Isolate von Enterobacter cloacae gesammelt. Zehn CREL-Stämme wurden für die weitere Forschung gesammelt. Die Speziesidentifikationen und minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) aller getesteten Antibiotika wurden mit dem Vitek 2 Compact-System (BioMerieux, Frankreich) analysiert und durch die Disk-Diffusion-Methode ergänzt. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde durchgeführt, um Extended-Spectrum-β-Lactamase (ESBL) und Carbapenemase-Resistenzgene nachzuweisen.

Ergebnisse: Die Ergebnisse zeigten, dass die meisten Isolate gegenüber getesteten Antibiotika empfindlich blieben, die Resistenzrate von Cefepim jedoch in den letzten Jahren zugenommen hat. Ein Stamm, der die Metallo-β-Lactamase NDM-1 von New Delhi und die Imipenem-Hydrolase IMP-4 co-produziert. NDM-1- und IMP-4-produzierende Isolate zeigen, dass eine aktive Überwachung erforderlich ist, um die weitere Ausbreitung der Bakterien zu verhindern. Die Multilocus-Sequenztypisierung (MLST) zeigte, dass zwei KPC-produzierende Isolate ST93 zugeordnet sind, zwei Isolate, die NDM-1 tragen und ST1120 zugeordnet sind. Darüber hinaus zeigte die MEGA-Analyse, dass ST93, ST256 und ST1120 eine Homologie aufweisen, was zeigt, dass CREL in unserem Gebiet ein potenzielles Ausbreitungsrisiko birgt.

Schlussfolgerungen: Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine klonale Verbreitung von CREL in dieser Region auftreten kann und sollten ernst genommen werden. Unsere Studie unterstreicht die dringende Notwendigkeit, diese Isolate zu überwachen, um ihre weitere Ausbreitung zu verhindern.

Schlüsselwörter: Molekulare Analyse der Antibiotikaempfindlichkeit von Enterobacter cloacae.


Modellierung der Auswirkungen der Einführung eines neuen Antibiotikums in einem Krankenhaus: Eine Fallstudie

Die Zunahme der Antibiotikaresistenz stellt weiterhin ein Risiko für die öffentliche Gesundheit dar, da nur sehr wenige neue Antibiotika hergestellt werden und Bakterien, die gegen derzeit verschriebene Antibiotika resistent sind, wachsen. In einer typischen Krankenhausumgebung kann es vorkommen, dass Patienten mit Bakterien besiedelt sind, die gegen ein einzelnes Antibiotikum resistent sind, oder bei einer akuteren Bedrohung können Patienten mit Bakterien besiedelt sein, die gegen mehrere Antibiotika resistent sind. Es wurden Vorkehrungen getroffen, um das Wachstum und die Verbreitung antimikrobieller Resistenzen zu verhindern, wie beispielsweise eine Verringerung der Verteilung von Antibiotika und vermehrtes Händewaschen und Barrierepräventionen, jedoch ist der Anstieg dieser Resistenz immer noch offensichtlich. Infolgedessen gibt es eine neue Bewegung, die versucht, die Notwendigkeit der Entwicklung neuer Antibiotika zu überprüfen. In diesem Artikel verwenden wir mathematische Modelle, um die möglichen Vorteile der Einführung eines neuen Antibiotikums in dieser Umgebung durch diese Modelle zu untersuchen, wir untersuchen den Einsatz eines neuen Antibiotikums, das auf verschiedene Weise verteilt wird, und wie dies die Gesamtresistenz im Krankenhaus reduzieren könnte. Wir vergleichen mehrere verschiedene Modelle, in denen sowohl mit einfach- als auch mit dual-resistenten Bakterien besiedelte Patienten vorliegen, darunter ein Modell ohne zusätzliche Behandlungsprotokolle für die mit dual-resistenten Bakterien besiedelte Population sowie Modelle mit Isolierung und/oder Behandlung mit einem neuen Antibiotikum. Wir untersuchen die Vorteile und Grenzen jedes Szenarios in den vorgestellten Simulationen.


9.3: Antibiotika - Biologie

Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wird weithin als Gentherapievektor bevorzugt und in über 200 klinischen Studien international getestet. Um die gezielte Zufuhr zu verbessern, wurden verschiedene genetische Kapsidmodifikationen, wie die Insertion von Targeting-Proteinen/Peptiden in die Kapsidhülle, mit einigem Erfolg untersucht, aber größere Insertionen haben oft unvorhersehbare schädliche Auswirkungen auf die Kapsidbildung und Genzufuhr. Hier demonstrieren wir eine modulare Plattform für die posttranslationale Integration exogener Peptide und Proteine ​​auf das AAV-Capsid unter Beibehaltung der Vektorfunktionalität. Wir dekorierten das AAV-Capsid mit Leucin-Zipper-Coiled-Coil-Bindungsmotiven, die eine spezifische nichtkovalente Heterodimerisierung aufweisen. AAV-Kapside zeigen mit diesem Ansatz erfolgreich Hexahistidin-markierte Peptide, wie durch die Nickelsäulenaffinität demonstriert. Diese Protein-Display-Plattform kann den Einbau biologischer Einheiten auf der AAV-Oberfläche erleichtern, wodurch die Möglichkeiten zur Vektorverstärkung und -technik erweitert werden.

Adenosintriphosphat und kohlenstoffeffizienter Weg zum Biokraftstoff der zweiten Generation, Isopentanol
  • Christopher B. Eiben ,
  • Tian Tian ,
  • Mitchell G. Thompson ,
  • Daniel Mendez-Perez ,
  • Nurgul Kaplan,
  • Garima Goyal,
  • Jennifer Chiniquy,
  • Nathan J. Hillson ,
  • Taek Soon Lee, und
  • Jay D. Keasling*

Der Klimawandel erfordert die Entwicklung CO2-neutraler oder negativer Wege zu Chemikalien, die derzeit aus fossilem Kohlenstoff hergestellt werden. In diesem Beitrag demonstrieren wir einen Weg von der erneuerbaren Ressource Glucose zum Biokraftstoff der nächsten Generation Isopentanol, indem wir den Isovaleryl-CoA-Biosyntheseweg aus Myxococcus xanthus und eine Butyryl-CoA-Reduktase aus Clostridium acetobutylicum paaren. Die beste Kombination aus Plasmid und Escherichia coli-Stamm ergibt 80,50 ± 8,08 (SD) mg/L Isopentanol nach 36 h unter mikroaeroben Bedingungen mit einer Oleylalkohol-Überlagerung. Darüber hinaus zeigt das System auch eine starke Präferenz für die Isopentanol-Produktion gegenüber Prenol unter mikroaeroben Bedingungen. Schließlich erfordert der Stoffwechselweg null Adenosintriphosphat und kann theoretisch mit nichtoxidativer Glykolyse gepaart werden, wobei die Kombination aus Glukose redox-balanciert ist, wodurch ein unnötiger Kohlenstoffverlust als CO2 vermieden wird. Diese Wegeigenschaften machen den Isovaleryl-CoA-Weg zu einem attraktiven Weg zur Isopentanol-Produktion zur weiteren Optimierung.

Entwickelte lebende Materialien basierend auf Adhäsin-vermitteltem Einfangen von programmierbaren Zellen
  • Shuaiqi Guo* ,
  • Emilien Dubuc,
  • Yahav Rave,
  • Mick Verhagen,
  • Simone A. E. Twisk,
  • Tim van der Hek,
  • Guido J. M. Oerlemans ,
  • Maxime C. M. van den Oetelaar,
  • Laura S. van Hazendonk ,
  • Mariska Brüls,
  • Bruno V. Eijkens ,
  • Pim L. Joostens ,
  • Sander R. Keij ,
  • Weizhou Xing ,
  • Martijn Nijs,
  • Jitske Stalpers ,
  • Manoj Sharma,
  • Marieke Gerth,
  • Roy J. E. A. Boonen,
  • Kees Verduin,
  • Maarten Merkx,
  • Ilja K. Voets* , und
  • Tom F. A. de Greef*

Technisch hergestellte lebende Materialien haben das Potenzial für weitreichende Anwendungen wie die Biosensorik und die Behandlung von Krankheiten. Programmierbare Zellen stellen die funktionelle Grundlage für lebende Materialien dar, ihre Freisetzung in die Umwelt wirft jedoch zahlreiche Bedenken hinsichtlich der biologischen Sicherheit auf.Aktuelle Designs, die die Freisetzung gentechnisch veränderter Zellen begrenzen, beinhalten typischerweise die Herstellung von mehrschichtigen Hybridmaterialien mit porösen Matrizen im Submikrometerbereich. Dennoch begrenzen die strengen physikalischen Barrieren die Diffusion von Makromolekülen und damit das Repertoire an Molekülen, die als Reaktion auf Kommunikationssignale zwischen Zellen und ihrer Umgebung aktiviert werden können. Hier entwickeln wir ein neuartiges lebendes Material mit dem Titel „Platform for Adhesin-mediated Trapping of Cells in Hydrogels“ (PATCH). Diese Technologie basiert auf manipulierten E. coli, die ein Adhäsionsprotein aufweisen, das von einem antarktischen Bakterium mit einer hohen Affinität zu Glukose stammt. Das Adhäsin verankert E. coli stabil in dextranbasierten Hydrogelen mit großen Porendurchmessern (10–100 µm) und reduziert das Austreten von Bakterien in die Umwelt um das bis zu 100-fache. Als Anwendung von PATCH haben wir E. coli so konstruiert, dass es das Bakteriocin Lysostaphin absondert, das spezifisch Staphyloccocus aureus mit geringer Wahrscheinlichkeit abtötet, Antibiotikaresistenzen zu erhöhen. Wir haben gezeigt, dass lebende Materialien, die diese Lysostaphin-sezernierenden E. coli enthalten, das Wachstum von S. aureus, einschließlich des gegen Methicillin (MRSA) resistenten Stammes, hemmen. Unsere abstimmbare Plattform ermöglicht die stabile Integration programmierbarer Zellen in Hydrogele auf Dextran-Basis, ohne die freie Diffusion von Makromolekülen zu beeinträchtigen, und könnte potenzielle Anwendungen in der Biotechnologie und Biomedizin haben.

Genetische Codeerweiterung, Proteinexpression und Proteinfunktionalisierung in Bacillus subtilis

Die ortsspezifische chemische Modifikation von Proteinen durch den Einbau nichtkanonischer Aminosäuren ermöglicht vielfältige Anwendungen wie Bildgebung, Sondierung und Erweiterung von Proteinfunktionen sowie die präzise Entwicklung von Therapeutika. Hier berichten wir über eine allgemeine Strategie, die den Einbau nichtkanonischer Aminosäuren in Zielproteine ​​mit der Amber-Suppressionsmethode und deren effiziente Sekretion im biotechnologisch relevanten Expressionswirt Bacillus subtilis ermöglicht. Dies ermöglicht eine effiziente Reinigung von Zielproteinen direkt aus dem Überstand, gefolgt von deren Funktionalisierung mittels Klick-Chemie. Wir nutzten diese Strategie, um Norbornen-Lysin ortsspezifisch in einen einkettigen Antikörper einzuführen und ihn mit Fluorophoren zum Nachweis menschlicher Zielproteine ​​zu funktionalisieren.

Die gezielte Evolution des Stoffwechselwegs ermöglicht eine funktionelle Pterin-abhängige aromatische Aminosäure-Hydroxylierung in Escherichia coli
  • Hao Luo* ,
  • Lei Yang,
  • Siehe Hyeuk Kim ,
  • Melodie Wulff,
  • Adam M. Feist ,
  • Markus Herrgard und
  • Bernhard Ø. Palsson

Die Tetrahydrobiopterin-abhängige Hydroxylierung aromatischer Aminosäuren ist der erste Schritt in der Biosynthese vieler neuroaktiver Verbindungen beim Menschen. Eine grundlegende Herausforderung beim Aufbau dieser Stoffwechselwege in Escherichia coli ist die Bereitstellung des nicht-nativen Hydroxylase-Cofaktors Tetrahydrobiopterin. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine genetische Selektion entwickelt, die auf der Tyrosinsyntheseaktivität der Phenylalanin-Hydroxylase beruht. Mit Hilfe der adaptiven Laborevolution demonstrieren wir die Verwendung dieser Auswahl, um zu entdecken: (1) ein minimales Set an heterologen Enzymen und eine Wirts-folE (T198I)-Mutation, um diese Art von Hydroxylierungschemie in ganzen Zellen zu erreichen, (2) funktionelle Komplementierung von Tetrahydrobiopterin durch indigene Cofaktoren und (3) eine Tryptophan-Hydroxylase-Mutation zur Verbesserung des Proteinreichtums. Somit wurde das Ziel einer funktionellen Hydroxylierung aromatischer Aminosäuren in E. coli durch eine gezielte Evolution des Stoffwechselweges erreicht.

SPLIT: Stabile Proteinkoazervation unter Verwendung eines lichtinduzierten Übergangs
  • Ellen H. Reed ,
  • Benjamin S. Schuster ,
  • Matthew C. Gut, und
  • Daniel A. Hammer

Proteinkoazervate dienen als Hubs zur Konzentration und Sequestrierung von Proteinen und Nukleotiden und fungieren somit als membranlose Organellen zur Manipulation der Zellphysiologie. Wir haben ein koazervierendes Protein entwickelt, um abstimmbare, synthetische membranlose Organellen zu erzeugen, die sich als Reaktion auf einen einzelnen Lichtimpuls zusammensetzen. Die Koazervation wird durch die intrinsisch ungeordnete RGG-Domäne des Proteins LAF-1 angetrieben, und die Optoreaktionsfähigkeit wird durch das Protein PhoCl kodiert, das als Reaktion auf 405-nm-Licht spaltet. Wir entwickelten ein Fusionsprotein, das eine löslich machende Maltose-bindende Proteindomäne, PhoCl, und zwei Kopien der RGG-Domäne enthält. Mehrere Sekunden Belichtung bei 405 nm reichen aus, um PhoCl zu spalten, die Solubilisierungsdomäne zu entfernen und eine RGG-getriebene Koazervation innerhalb von Minuten in zellgroßen Wasser-in-Öl-Emulsionen zu ermöglichen. Eine optimierte Version dieses Systems zeigte eine lichtinduzierte Koazervation in Saccharomyces cerevisiae. Die hier beschriebenen Verfahren bieten neuartige Strategien zur Induktion der Proteinphasentrennung unter Verwendung von Licht.

Artikel
Hefe-Oberflächen-Display-System zur erleichterten Produktion und Anwendung von Phagen-Endolysin

Bakteriophagen-Endolysin ist eine der möglichen Alternativen zu herkömmlichen Antibiotika, aber die intrinsischen Beschränkungen des bakteriellen Expressionssystems können die umfassende Anwendung dieses therapeutischen Proteins untergraben. Um solche Einschränkungen zu umgehen, haben wir ein Hefe-Oberflächen-Display-System als neuartige Expressionsplattform für Endolysin eingeführt. Endolysin LysSA11 aus dem Staphylokokken-Phagen SA11 wurde in Saccharomyces cerevisiae exprimiert und an der Oberfläche präsentiert, um eine ausreichende antimikrobielle Aktivität gegen Staphylococcus aureus zu zeigen. Ohne jegliche Proteinisolierung oder Reinigungsverfahren zeigten wir, dass eine direkte Behandlung von LysSA11-präsentierenden Hefezellen eine 5-log-Reduktion von lebensfähigem Staphylococcus aureus innerhalb von 3 Stunden erreichen kann. Darüber hinaus zeigte das an der Oberfläche präsentierte LysSA11 eine überlegene Stabilität gegenüber der löslichen Form von gereinigtem LysSA11 während einer 14-tägigen Lagerung in einer gekühlten Umgebung. Wir schlagen vor, dass das Hefe-Oberflächen-Display-System eine effiziente, stabile und unkomplizierte Plattform für die Produktion und antibakterielle Anwendungen von Endolysin ist.

Design und Charakterisierung eines ikosaedrischen Proteinkäfigs aus einem Doppelfusionsprotein mit drei unterschiedlichen Symmetrieelementen
  • Kevin A. Kanone ,
  • Vy N. Nguyen ,
  • Christian Morgan und
  • Todd O. Yeates*

Ausgehend von einfachen Symmetrietypen, die vielen natürlichen Proteinoligomeren gemeinsam sind, ist es in mehreren neueren Studien gelungen, komplexe selbstorganisierende Proteinarchitekturen zu entwickeln, die an die in der Natur entwickelten, sich aber von denen unterscheiden. Das Design symmetrischer Proteinkäfige mit einem breiten Eigenschaftsspektrum war für potenzielle Anwendungen in den Bereichen Medizin, Energie, Bildgebung und mehr von besonderem Interesse. In dieser Studie haben wir drei natürlich symmetrische Proteinkomponenten genetisch miteinander verschmolzen – ein Pentamer, Trimer und Dimer – in einer Weise, die entworfen wurde, um einen selbstorganisierenden ikosaedrischen Proteinkäfig zu schaffen, der aus 60 Kopien der Proteinuntereinheit aufgebaut ist. Die Verbindung zwischen Pentamer und Dimer basierte auf einer kontinuierlichen gemeinsamen α-Helix, um die relative Orientierung dieser Komponenten zu kontrollieren. Nach Auswahl geeigneter Bauteile durch rechnerische Methoden wurde ein Konstrukt mit günstigen Designeigenschaften experimentell getestet. Elektronenmikroskopie mit negativer Färbung und Verfahren im Lösungszustand zeigten die erfolgreiche Bildung eines ikosaedrischen Käfigs mit 60 Untereinheiten, 2,5 MDa Masse und 30 nm Durchmesser. Diverse experimentelle Studien legten auch einen erheblichen Grad an Flexibilität und asymmetrischer Deformation des assemblierten Partikels in Lösung nahe. Die Ergebnisse fügen weitere Beispiele für Erfolge und Herausforderungen beim Design atomar präziser Proteinmaterialien hinzu.

Hocheffiziente Biosynthese von Hypoxanthin in Escherichia coli und Transkriptom-basierte Analyse des Purinstoffwechsels
  • Min Liu,
  • Yingxin Fu,
  • Wenjie Gao,
  • Mo Xian* , und
  • Guang Zhao*

Nukleoside und Purinanaloga haben mehrere Funktionen in der Zellphysiologie, in Lebensmittelzusatzstoffen und Pharmazeutika, und einige werden in großem Maßstab unter Verwendung verschiedener Mikroorganismen hergestellt. Die Biosynthese von Purinen fehlt jedoch noch. In der vorliegenden Studie haben wir den de novo Purinbiosyntheseweg, verzweigte Wege und einen globalen Regulator entwickelt, um eine hocheffiziente Hypoxanthinproduktion durch Escherichia coli zu gewährleisten. Der manipulierte Stamm Q2973 produzierte 1243 mg/l Hypoxanthin in der Fed-Batch-Fermentation, begleitet von einer extrem geringen Akkumulation von Nebenprodukten wie Acetat und Xanthin. Wir führten auch eine globale Genexpressionsanalyse durch, um den Mechanismus zur Verbesserung der Hypoxanthinproduktion zu veranschaulichen. Diese Studie demonstrierte die Machbarkeit einer groß angelegten Hypoxanthinproduktion durch einen gentechnisch veränderten E. coli-Stamm und bietet eine Referenz für nachfolgende Studien zu Purinanaloga und Nukleosiden.

Verknüpfung von Engineered Cells mit ihren digitalen Zwillingen: Ein Versionskontrollsystem für das Strain Engineering
  • Jonathan Tellechea-Luzardo,
  • Karl Winterhalter,
  • Paweł Widera,
  • Jerzy Kozyra,
  • Victor de Lorenzo und
  • Natalio Krasnogor*

Da DNA-Sequenzierung und -Synthese billiger und leichter zugänglich werden, werden Umfang und Komplexität von Bioengineering-Projekten zunehmen. Obwohl es eine zunehmende Konvergenz zwischen Biotechnologie und digitaler Technologie gibt, verringert ein Defizit an Software und Labortechniken die Fähigkeit, die Biotechnologie agiler, reproduzierbarer und transparenter zu machen, während gleichzeitig die Sicherheit von Konstrukten der synthetischen Biologie eingeschränkt wird . Um einige dieser Probleme teilweise anzugehen, stellt dieses Papier einen Ansatz vor, um technisch hergestellte Zellen physisch mit ihrem digitalen Fußabdruck zu verknüpfen – wir nannten es digitales Twinning. Dies ermöglicht die Verfolgung der gesamten Entwicklungsgeschichte einer Zelllinie in einem spezialisierten Versionskontrollsystem für kollaboratives Stamm-Engineering über einfache Barcode-Protokolle.

Mitochondriale Kompartimentierung verleiht dem rekursiven 2-Ketosäure-Weg Spezifität: Erhöhung der Isopentanol-Produktion in Saccharomyces cerevisiae

Rekursive Elongationspfade erzeugen mit jedem iterativen Zyklus Verbindungen mit zunehmender Kohlenstoffkettenlänge. Von besonderem Interesse sind 2-Ketosäuren, die aus rekursiver Elongation abgeleitet sind und als Vorläufer einer wertvollen Klasse fortschrittlicher Biokraftstoffe dienen, die als verzweigtkettige höhere Alkohole (BCHAs) bekannt sind. Protein-Engineering wurde verwendet, um die Anzahl der abgeschlossenen iterativen Elongationszyklen zu erhöhen, dennoch bleibt eine spezifische Produktion von längerkettigen 2-Ketosäuren schwierig zu erreichen. Hier zeigen wir, dass die mitochondriale Kompartimentierung eine effektive Strategie ist, um die Spezifität von rekursiven Signalwegen zu erhöhen, um längerkettige Produkte zu bevorzugen. Unter Verwendung der 2-Ketosäure-Elongation als Proof of Concept zeigen wir, dass die Überexpression der drei Elongationsenzyme – LEU4, LEU1 und LEU2 – in Mitochondrien eines Isobutanol-Produktionsstamms zu einem 2,3-fachen Anstieg des Isopentanol-zu-Isobutanol-Produktverhältnisses relativ führt zur Überexpression der gleichen Elongationsenzyme im Cytosol und eine 31-fache Erhöhung im Vergleich zur Wildtyp-Enzymexpression. Durch die Reduzierung des Verlustes an Zwischenprodukten können wir die Isopentanolproduktion weiter auf 1,24 ± 0,06 g/L Isopentanol steigern. In diesem Stamm macht Isopentanol 86% der gesamten produzierten BCHAs aus und erreicht gleichzeitig den höchsten Isopentanol-Titer, der für Saccharomyces cerevisiae berichtet wurde. Die Lokalisierung der Elongationsenzyme in Mitochondrien ermöglicht die Entwicklung von Stämmen, in denen Isopentanol bis zu 93% der BCHA-Produktion ausmacht. Diese Arbeit etabliert die mitochondriale Kompartimentierung als einen neuen Ansatz, um hohe Titer und Produktspezifitäten größerer Produkte aus rekursiven Signalwegen zu begünstigen.

MEMO: Eine Methode zur Berechnung von Stoffwechselmodulen für zellfreie Produktionssysteme

Zellfreie Bioproduktionssysteme stellen eine vielversprechende Alternative zu klassischen mikrobiellen Fermentationsverfahren dar, um aus biologischen Rohstoffen Mehrwertprodukte zu synthetisieren. Ein wesentlicher Schritt zur Etablierung zellfreier Produktionssysteme ist die Identifizierung geeigneter Stoffwechselmodule mit definierten Eigenschaften. Hier präsentieren wir MEMO, einen neuartigen rechnerischen Ansatz, um kleinste Stoffwechselmodule mit spezifischen stöchiometrischen und thermodynamischen Randbedingungen zu finden, die das Design zellfreier Systeme in vielerlei Hinsicht unterstützen. Eine zentrale Herausforderung für einen dauerhaften Betrieb zellfreier Systeme ist insbesondere die Regeneration von genutzten Cofaktoren (wie ATP und NAD(P)H). Bei einem Produktionspfad mit bestimmten Cofaktoranforderungen kann MEMO verwendet werden, um kleinste Regenerationsmodule zu berechnen, die diese Cofaktoren mit den erforderlichen Stöchiometrien zurückgewinnen. MEMO integriert die stöchiometrischen und thermodynamischen Randbedingungen in einem einzigen gemischt-ganzzahligen linearen Programm, das dann gelöst werden kann, um die kleinsten geeigneten Module aus einer gegebenen Reaktionsdatenbank zu finden. Wir veranschaulichen die Anwendbarkeit von MEMO, indem wir Regenerationsmodule für den kürzlich veröffentlichten synthetischen CETCH-Zyklus zur in vitro-Kohlendioxidfixierung berechnen. Wir zeigen, dass MEMO sehr flexibel die diversen Einschränkungen des CETCH-Zyklus berücksichtigt (z. B. Regeneration von 1 ATP, 4 NADPH und von 1 Acetylgruppe ohne Nettoproduktion von CO2 und mit zulässiger Nebenproduktion von Malat) und in der Lage ist mehrere Lösungen in angemessener Zeit in zwei großen Reaktionsdatenbanken (MetaCyc und BiGG) zu bestimmen. Die vielversprechendsten Regenerationsmodule, die gefunden wurden, verwenden Glycerin als Substrat und benötigen nur 8 enzymatische Schritte. Es wird auch gezeigt, dass einige dieser Module robust gegenüber dem spontanen Verlust von Cofaktoren sind (z. B. Oxidation von NAD(P)H oder Hydrolyse von ATP). Darüber hinaus zeigen wir, dass MEMO auch zellfreie Produktionssysteme mit integrierter Produktsynthese und Kofaktorregeneration finden kann. Insgesamt bietet MEMO eine leistungsstarke Methode, um Stoffwechselmodule zu finden und zellfreie Produktionssysteme als eine besondere Anwendung zu entwerfen.

Gezielte Entwicklung der Stringenz des LuxR Vibrio Fischeri Quorumsensor ohne AUS-Zustandsauswahl
  • Yuki Kimura,
  • Shigeko Kawai-Noma ,
  • Kyoichi Saito und
  • Daisuke Umeno*

Stringenz (Low Leak) ist eine der wichtigsten Spezifikationen, die für genetische Schaltkreise und Induktionssysteme erforderlich sind, aber es ist schwierig, sich weiterzuentwickeln, ohne den maximalen Ausgangspegel zu opfern. Dieses Problem rührt auch vom Fehlen wirklich abstimmbarer negativer Selektionsverfahren her. Dieser Artikel berichtet, dass bei Mutationen manchmal mit überraschender Häufigkeit streng wechselnde Varianten auftreten können. Wir haben die zuvor generierten Leaky-Varianten von LuxR, dem quorum-sensing Transcription Activator von Vibrio fischeri, zufällig mutiert, um die Stringenz wiederherzustellen. Wir fanden heraus, dass 10–20% der Gesamtbevölkerung im Vergleich zu ihren Eltern ein signifikant verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis aufwiesen. Dies deutete darauf hin, dass diese Mutanten durch den Verlust der Faltungsfähigkeit durch die Akkumulation destabilisierender Mutationen entstanden sind, nicht durch die Einführung seltener adaptiver Mutationen, wodurch sie zu AHL-abhängigen Ordnern wurden. Nur vier Runden Mutagenese und ON-State-Selektion führten zur Dominanz der gesamten Population durch die verbesserten Varianten mit geringem Leck, ohne direkten Selektionsdruck auf Stringenz. Mit dieser überraschenden Häufigkeit sollte die Umwandlung in die „ligandensüchtigen Ordner“ eine der vorherrschenden Formen der sich entwickelnden Stringenz sowohl im Labor als auch in der Natur sein, und der hier beschriebene Workflow bietet eine schnelle und vielseitige Methode zur Verbesserung der Signal-zu- Rauschverhältnis verschiedener genetischer Schalter.

Entwicklung von Hochleistungs-Ganzzell-Biosensoren mit Hilfe statistischer Modellierung
  • Adokiye Berepiki,
  • Ross Kent,
  • Leopoldo F. M. Machado und
  • Neil Dixon*

Ganzzell-Biosensoren sind genetische Systeme, die das Vorhandensein einer Chemikalie oder eines anderen Stimulus mit einer benutzerdefinierten Genexpressionsausgabe für Anwendungen in der Sensorik und Steuerung verknüpfen. Allerdings ist das Genexpressionsniveau von Biosensor-Regulationskomponenten, die für eine optimale Leistung erforderlich sind, nicht intuitiv, und klassische iterative Ansätze erkunden den multidimensionalen experimentellen Raum nicht effizient. Um diese Herausforderungen zu meistern, haben wir eine Design-of-Experiment (DoE)-Methodik verwendet, um die Genexpressionsniveaus effizient zu kartieren und Biosensoren mit verbesserter Leistung bereitzustellen. Diese Methodik wurde auf zwei Biosensoren angewendet, die auf katabole Abbauprodukte von Ligninbiomasse, Protocatechusäure und Ferulasäure, reagieren. Unter Verwendung von DoE haben wir das Dosis-Reaktions-Verhalten von Biosensoren systematisch modifiziert, indem wir die maximale Signalausgabe (bis zu 30-fache Erhöhung), Verbesserung des Dynamikbereichs (>500-fach), Erweiterung des Erfassungsbereichs (∼4 Größenordnungen), Erhöhung der Empfindlichkeit ( um das >1500-fache) und modulierte die Steigung der Kurve, um Biosensordesigns mit sowohl digitalem als auch analogem Dosis-Wirkungs-Verhalten zu ermöglichen. Diese DoE-Methode ist vielversprechend für die Optimierung von Regulationssystemen und Stoffwechselwegen, die aus neuartigen, schlecht charakterisierten Teilen aufgebaut sind.

Entwicklung eines Quorum-Sensing-basierten Schaltkreises zur Kontrolle der Zusammensetzung der Kokulturpopulation in einem Naringenin-Produktionssystem

Mit der Verbesserung der synthetischen Biologie und der Werkzeuge des Metabolic Engineering ist es möglich, komplexere mikrobielle Synthesesysteme zu konstruieren, die durch die in einer einzelnen Zelle verfügbaren Maschinen und Ressourcen begrenzt sein können. Die Kokultur-Fermentation ist eine vielversprechende Strategie zur Überwindung dieser Beschränkungen durch die Verteilung von Zielen auf Subpopulationen, aber die primäre Methode zur Kontrolle der Zusammensetzung der Kokultur von Produktionssystemen war auf die Kontrolle der Inokulum-Zusammensetzung beschränkt. Wir haben einen Quorum Sensing (QS)-basierten Wachstumsregulationskreislauf entwickelt, der einen zusätzlichen Parameter zur Regulierung der Zusammensetzung einer Kokultur im Verlauf der Fermentation bereitstellt. Die Implementierung dieses Tools in einer Naringenin-produzierenden Kokultur führte zu einem 60-prozentigen Titeranstieg gegenüber einem System, das nur durch variierende Impfverhältnisse optimiert wurde. Wir haben außerdem gezeigt, dass der Wachstumskontrollkreis in Kombination mit einem Kommunikationsmodul implementiert werden kann, das die Transkription in einer Subpopulation zur Koordination des Verhaltens an die Zelldichte der anderen Population koppelt, was zu einer zusätzlichen Verbesserung des Naringenin-Titers um 60 % führt.

Extrachromosomale Gentechnik der marinen Kieselalge Phaeodactylum tricornutum Ermöglicht die heterologe Produktion von Monoterpenoiden
  • Michele Fabris* ,
  • Jestin George,
  • Unnikrishnan Kuzhiumparambil ,
  • Caitlin A. Lawson ,
  • Ana Cristina Jaramillo-Madrid ,
  • Raffaela M. Abbriano ,
  • Claudia E. Vickers und
  • Peter Ralph

Geraniol ist ein kommerziell relevantes pflanzliches Monoterpenoid, das ein Hauptbestandteil von ätherischem Rosenöl ist und als Insektenschutzmittel verwendet wird. Geraniol ist auch ein wichtiges Zwischenprodukt bei der Biosynthese der monoterpenoiden Indolalkaloide (MIAs), einer Gruppe von über 2000 Verbindungen, zu denen hochwertige Pharmazeutika gehören. Da Pflanzen von Natur aus extrem kleine Mengen dieser Moleküle produzieren und ihre chemische Synthese komplex ist, ist die industrielle Beschaffung dieser Verbindungen teuer und ineffizient. Daher wird derzeit nach mikrobiellen Wirten gesucht, die geeignet sind, MIA-Vorläufer durch synthetische Biologie und metabolisches Engineering herzustellen. Hier haben wir die Eignung einer eukaryontischen Mikroalge, der marinen Kieselalge Phaeodactylum tricornutum, für die heterologe Produktion von Monoterpenoiden untersucht.Die Profilierung des endogenen Stoffwechsels ergab, dass P. tricornutum im Gegensatz zu anderen Mikroben, die für die industrielle Produktion von Terpenoiden eingesetzt werden, freie Pools des Vorläufers Geranyldiphosphat ansammelt. Um das Potenzial für größere Anwendungen in der synthetischen Biologie zu bewerten, haben wir P. tricornutum durch extrachromosomale, episomenbasierte Expression für die heterologe Biosynthese des MIA-Zwischenprodukts Geraniol konstruiert. Durch ein Profiling der Geraniolproduktion aufgrund verschiedener genetischer und kultivierter Arrangements erreichte P. tricornutum unter phototrophen Bedingungen den maximalen Geranioltiter von 0,309 mg/L. Diese Arbeit liefert (i) eine detaillierte Analyse des endogenen Terpenoidmetabolismus von P. tricornutum, (ii) eine erfolgreiche Demonstration der extrachromosomalen Expression für das Engineering von Stoffwechselwegen mit potentiellen Gen-Stacking-Anwendungen und (iii) einen überzeugenden Machbarkeitsnachweis für die Eignung von P. tricornutum als neuartige Produktionsplattform für heterologe Monoterpenoide mit Potenzial für komplexes Pathway-Engineering, das auf die heterologe Produktion von MIAs abzielt.

Neuer Einblick in die Plasmid-getriebene T7-RNA-Polymerase in Escherichia coli und Verwendung als genetischer Verstärker für einen Biosensor

T7-RNA-Polymerase (T7RNAP) und T7-Promotor sind leistungsstarke genetische Komponenten, daher könnte ein Plasmid-gesteuerter T7 (PDT7)-Genschaltkreis breit für die synthetische Biologie verwendet werden. Das begrenzte Wissen über die Toxizität und Instabilität eines solchen Systems schränkt jedoch seine Anwendung noch immer ein. Hier konstruierten wir 16 konstitutive genetische Schaltkreise von PDT7 und untersuchten die orthogonalen Effekte auf Toxizität und Instabilität. Die T7-Toxizität wurde aus den Konstruktionsprozessen und der Charakterisierung des Zellwachstums aufgeklärt, was die Bedeutung einer optimalen Orthogonalität für PDT7 zeigt. Außerdem wurde eine Proteinanalyse durchgeführt, um zu validieren, wie das T7-System den Zellmetabolismus beeinflusst und zu der Instabilität führt. Die Anwendung von konstitutivem PDT7 in funktionellen Proteinexpressionen, einschließlich Carboanhydrase, Lysin-Decarboxylase und 5-ALA-Synthetase, wurde demonstriert. Darüber hinaus wurde PDT7 als genetischer Verstärker für E. coli-Zell-basierte Biosensoren entwickelt, was die zukünftigen Möglichkeiten von PDT7 in der synthetischen Biologie veranschaulichte.

Refactoring Ehrlich-Pfad für die Produktion von 2-Phenylethanol mit hoher Ausbeute in Yarrowia lipolytica

Eine effiziente mikrobielle Synthese von Chemikalien erfordert die koordinierte Zufuhr von Vorläufern und Cofaktoren, um das Zellwachstum und die Produktbildung aufrechtzuerhalten. Substrate mit unterschiedlichen Eintrittspunkten in das Stoffwechselnetzwerk haben unterschiedliche energetische und Redox-Zustände. Im Allgemeinen könnte die gleichzeitige Zufuhr von Substraten den langwierigen und stark regulierten nativen Stoffwechsel umgehen und eine hohe Kohlenstoffumwandlungsrate ermöglichen. Mit dem Ziel, das hochwertige, nach Rosen riechende 2-Phenylethanol (2-PE) in Y. lipolytica effizient zu synthetisieren, analysierten wir die stöchiometrischen Beschränkungen des Ehrlich-Wegs und stellten fest, dass die Selektivität des Ehrlich-Wegs und die Verfügbarkeit von 2-Oxoglutarat die geschwindigkeitsbegrenzenden Faktoren. Die schrittweise Refaktorierung des Ehrlich-Wegs führte uns zur Identifizierung der optimalen katalytischen Module, bestehend aus l-Phenylalaninpermease, Ketosäureaminotransferase, Phenylpyruvatdecarboxylase, Phenylacetaldehydreduktase und Alkoholdehydrogenase. Andererseits schafft die mitochondriale Kompartimentierung von 2-Oxoglutarat von Natur aus einen Engpass für die effiziente Assimilation von L-Phenylalanin, was die 2-PE-Produktion einschränkt. Um den Transport von 2-Oxoglutarat (aKG) durch die Mitochondrienmembran zu verbessern, haben wir einen zytosolischen aKG-Quellweg konstruiert, indem wir eine bakterielle Aconitase mit einer nativen Isocitrat-Dehydrogenase (ylIDP2) koppeln. Darüber hinaus haben wir auch Dicarbonsäuretransporter entwickelt, um die Verfügbarkeit von 2-Oxoglutarat weiter zu verbessern. Darüber hinaus produzierte der gentechnisch veränderte Stamm durch Blockieren der konkurrierenden Vorläuferwege und Abschwächung der Fettsäuresynthese 2669,54 mg/l 2-PE in Schüttelkolben, eine 4,16-fache Steigerung gegenüber dem Ausgangsstamm. Die Kohlenstoffumwandlungsausbeute erreicht 0,702 g/g von 1-Phenylalanin, 95,0% des theoretischen Maximums. Die berichtete Arbeit erweitert unsere Möglichkeiten, den Ehrlich-Weg für die Produktion hochwertiger Aromaten in öligen Hefearten zu nutzen.

Verbesserung von cis,cis-Muconsäureproduktion in Saccharomyces cerevisiae durch Biosensor-Aided Genome Engineering
  • Guokun Wang,
  • Süleyman Øzmerih ,
  • Rogério Guerreiro,
  • Ana C. Meireles ,
  • Ana Carolas,
  • Nicholas Milne,
  • Michael K. Jensen ,
  • Bruno S. Ferreira und
  • Irina Borodina*

Muconsäure ist eine potenzielle Plattformchemikalie für die Herstellung von Nylon, Polyurethanen und Terephthalsäure. Aufgrund seiner zwei Doppelbindungen ist es auch ein attraktives funktionelles Copolymer in Kunststoffen. Derzeit existiert kein wirtschaftlich tragfähiges Verfahren zur Herstellung von Muconsäure. Um neuartige genetische Targets für eine verbesserte Produktion von cis,cis-Muconsäure (CCM) in der Hefe Saccharomyces cerevisiae zu nutzen, haben wir einen an die GFP-Expression gekoppelten CCM-Biosensor mit einer breiten dynamischen Reaktion zum Screenen von UV-Mutagenese-Bibliotheken von CCM-produzierenden Hefen eingesetzt . Mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung identifizierten wir einen Klon Mut131 mit einem 49,7% höheren CCM-Titer und einem 164% höheren Titer an biosynthetischem Intermediat-Protocatechusäure (PCA). Genom-Resequenzierung des Mut131 und Reverse Engineering identifizierte sieben kausale Missense-Mutationen der nativen Gene (PWP2, EST2, ATG1, DIT1, CDC15, CTS2 und MNE1) und eine Duplikation von zwei CCM-Biosynthesegenen, die Dehydroshikimat-Dehydratase und Catechol kodieren 1,2 -Dioxygenase, die zuvor nicht als Flusskontrolle erkannt wurden. Der Mut131-Stamm wurde durch Überexpression der Gene, die für PCA-Decarboxylase und AROM-Protein ohne Shikimat-Dehydrogenase-Domäne (Aro1pΔE) kodieren, und durch Wiederherstellung der URA3-Prototrophie weiter rational konstruiert. Der resultierende manipulierte Stamm produzierte 20,8 g/l CCM in kontrollierter Fed-Batch-Fermentation mit einer Ausbeute von 66,2 mg/g Glukose und einer Produktivität von 139 mg/l/h, was die höchsten berichteten Leistungskennzahlen in einer Hefe für de novo CCM . darstellt Produktion bis heute und die höchste Produktion einer aromatischen Verbindung in Hefe. Die Studie veranschaulicht den Nutzen der biosensorbasierten Selektion und bringt die Aussicht auf biobasierte Muconsäure näher.

Ein Escherichia coli Chassis zur Herstellung von elektrisch leitfähigen Protein-Nanodrähten
  • Toshiyuki Ueki,
  • David J. F. Walker,
  • Trevor L. Woodard ,
  • Kelly P. Nevin ,
  • Stephen S. Nonnenmann und
  • Derek R. Lovley*

Die auf Pilin basierenden elektrisch leitfähigen Protein-Nanodrähte (e-PNs) von Geobacter sulfurreducens sind ein revolutionäres elektronisches Material. Sie bieten neuartige Optionen für elektronische Sensoranwendungen und verfügen über die bemerkenswerte Fähigkeit, elektrische Energie aus der Luftfeuchtigkeit zu gewinnen. Technische Beschränkungen begrenzen jedoch den Massenanbau und die genetische Manipulation von G. sulfurreducens. Daher entwarfen wir einen Stamm von Escherichia coli zur Expression von e-PNs, indem wir ein Plasmid einführten, das ein induzierbares Operon mit E. coli-Genen für die Typ-IV-Pili-Biogenesemaschinerie und ein synthetisches Gen enthielt, das ein Peptidmonomer lieferte, das zu e . zusammengesetzt werden konnte -PNs. Die in E. coli exprimierten und mit einer einfachen Filtrationsmethode geernteten e-PNs hatten den gleichen Durchmesser (3 nm) und die gleiche Leitfähigkeit wie die in G. sulfurreducens exprimierten e-PNs. Diese Ergebnisse, gepaart mit der Robustheit von E. coli für die Massenkultivierung und dem umfangreichen E. coli-Werkzeugkasten für die genetische Manipulation, erweitern die Möglichkeiten für die großmaßstäbliche Herstellung neuartiger e-PNs erheblich.

Cofactor Engineering leitet den Sekundärmetabolismus um und steigert die Erythromycin-Produktion in Saccharopolyspora erythraea
  • Xiaobo Li,
  • Juni Chen,
  • Joakim M. Andersen ,
  • Ju Chu* , und
  • Peter R. Jensen*

Saccharopolyspora erythraea wird zur industriellen Herstellung von Erythromycin verwendet. Um die physiologische Rolle des intrazellulären Energiezustands bei der metabolischen Regulation durch S. erythraea zu untersuchen, überexprimierten wir zunächst den F1-Teil der endogenen F1F0-ATPase im ertragreichen Erythromycin produzierenden Stamm E3. Die F1-ATPase-Expression führte zu niedrigeren [ATP]/[ADP]-Verhältnissen, was mit einer starken Zunahme der Produktion eines rötlichen Pigments und einer verminderten Erythromycin-Produktion einherging. Nachfolgende Transkriptionsanalysen ergaben, dass die niedrigeren intrazellulären [ATP]/[ADP]-Verhältnisse eine pleotrope Regulation auf den Metabolismus von S. erythraea ausüben. Die niedrigeren [ATP]/[ADP]-Verhältnisse induzierten physiologische Veränderungen, um das Energiegleichgewicht wiederherzustellen, hauptsächlich über Wege, die dazu neigen, ATP zu produzieren oder NADH zu regenerieren. Der F1-ATPase-Überexpressionsstamm zeigte einen Zustand von Redoxstress, der mit einer Veränderung des Elektronentransports am Zweig der terminalen Oxidasen korrelierte, und S. erythraea lenkte den erhöhten glykolytischen Fluss in Richtung eines rötlichen Pigments, um die NADH-Bildung zu reduzieren. Die Produktion von Erythromycin wurde verringert, was dem Netto-ATP-Bedarf und dem über diesen Weg gebildeten überschüssigen NADH entspricht. Eine partielle Wachstumshemmung durch Apramycin erhöhte die intrazellulären [ATP]/[ADP]-Verhältnisse und zeigte eine positive Korrelation zwischen [ATP]/[ADP]-Verhältnissen und der Erythromycin-Synthese. Schließlich führte die Überexpression des gesamten F1F0-ATPase-Komplexes zu einer um 28% erhöhten Erythromycin-Produktion und einer deutlich reduzierten Pigmentsynthese in E3. Die Arbeit veranschaulicht eine praktikable Strategie zur Optimierung der Verteilung von Flüssen im Sekundärstoffwechsel.

Technische Hinweise
Design und Optimierung eines zellfreien Atrazin-Biosensors
  • Adam D. Silverman ,
  • Umut Akova ,
  • Khalid K. Alam ,
  • Michael C. Jewett* , und
  • Julius B. Glück*

Jüngste Fortschritte in der zellfreien synthetischen Biologie haben die Entwicklung molekularer In-vitro-Diagnostika vorangetrieben, die als wirksame Alternativen zu Ganzzell-Biosensoren dienen. Zellfreie Sensoren zum Nachweis von künstlichen organischen Wasserverunreinigungen wie Pestiziden sind jedoch spärlich, teilweise weil nur wenige charakterisierte natürliche biologische Sensoren solche Schadstoffe direkt erkennen können. Hier präsentieren wir eine Plattform für den zellfreien Nachweis einer kritischen Wasserverunreinigung, Atrazin, durch die Kombination eines zuvor charakterisierten Cyanursäure-Biosensors mit einem rekonstituierten Atrazin-zu-Cyanursäure-Stoffwechselweg, der aus mehreren proteinangereicherten Bakterienextrakten gemischt in a One-Pot-Reaktion. Unser zellfreier Sensor erkennt Atrazin innerhalb einer Stunde nach der Inkubation bei einem Aktivierungsverhältnis, das den zuvor berichteten Ganzzell-Atrazin-Sensoren überlegen ist. Wir zeigen auch, dass das Ansprechverhalten des Atrazinsensors durch Manipulation der Verhältnisse der angereicherten Extrakte in der zellfreien Reaktionsmischung eingestellt werden kann. Unser Ansatz, mehrere Stoffwechselschritte, die in proteinangereicherten zellfreien Extrakten kodiert sind, zu nutzen, um ein interessierendes Ziel in ein Molekül umzuwandeln, das von einem Transkriptionsfaktor erfasst werden kann, ist modular. Unsere Arbeit dient somit als effektiver Machbarkeitsnachweis für ein Schema der „metabolischen Biosensorik“, das eine schnelle, im Feld einsetzbare Detektion komplexer organischer Wasserverunreinigungen ermöglichen soll.

Erweiterung der CRISPR-Toolbox in Culicine Mosquitoes: In vitro Validierung von Pol III-Promotoren
  • Michelle A. E. Anderson,
  • Jessica Purcell,
  • Sebald A. N. Verkuijl,
  • Victoria C. Norman ,
  • Philip T. Leftwich ,
  • Tim Harvey-Samuel und
  • Luke S. Alphey*

CRISPR-Cas9-basierte „Gene Drive“-Technologien wurden als neuartiges und wirksames Mittel zur Bekämpfung von durch Mücken übertragenen menschlichen Krankheiten vorgeschlagen. Komplexere Designs als die bisher gezeigten – und ein erweiterter molekularer Werkzeugkasten, mit dem sie gebaut werden können – werden jedoch erforderlich sein, um die Probleme der Resistenzbildung/-entwicklung zu überwinden und die räumliche/zeitliche Begrenzung voranzutreiben. In Anbetracht dieses Bedarfs haben wir die sgRNA-Transkriptionsaktivitäten von 33 phylogenetisch unterschiedlichen Insekten-Polymerase-III-Promotoren unter Verwendung von drei krankheitsrelevanten Culicine-Mückenzelllinien (Aedes aegypti, Aedes albopictus und Culex quinquefasciatus) untersucht. Wir zeigen, dass U6-Promotoren speziesübergreifend mit einer Reihe von Transkriptionsaktivitätsniveaus wirken und finden 7SK-Promotoren aufgrund ihrer breiten phylogenetischen Aktivität besonders vielversprechend. Wir zeigen weiterhin, dass U6-Promotoren im Wesentlichen verkürzt werden können, ohne die Transkriptionsniveaus zu beeinflussen. Diese Ergebnisse werden für Forscher von großem Nutzen sein, die an der Entwicklung der nächsten Generation von Gene Drives beteiligt sind.


9.3: Antibiotika - Biologie

Diese Veränderungen waren mit der Gründung mehrerer medizinischer Einrichtungen verbunden. Die erste war 1924 die Abteilung für Kardiologie, die von Ignacio Chavez, M.D., geleitet wurde, und 1944 wurde das neue Nationale Institut für Kardiologie von Mexiko gegründet. Dieses Institut war weltweit das erste seiner Art, das sich auf die herzmedizinische Forschung und Lehre konzentrierte. Es war auch das erste Institut, das internationalen Status erlangte.

Chavez verwendete Wandgemälde des berühmten mexikanischen Wandmalers Diego Rivera, die am Eingang des Hauptgebäudes des Instituts ausgestellt waren, um die kardiologische Geschichte ab der Zeit Galens zu zeigen. Agustin Castellanos, M.D., begründete den intrakardialen Katheterismus, das Verfahren, bei dem ein Katheter durch das Lumen einer Arterie geführt und Kontrastmittel injiziert wird, um ein klares Bild des Herzens zu erhalten. Diese Technik wurde später von schwedischen Kardiologen modifiziert und ist heute als Angiokardiographie bekannt. Die renommierte Schule für Elektrokardiographie entstand in diesem Institut und erlangte weltweite Anerkennung unter der Leitung von Demetrio Sodi Pallares, M.D. und Enrique Cabrera, M.D. und ausländischen Mitarbeitern.

Die School of Pathology and Anatomy entwickelte sich unter der Leitung von Isaac Costero, M.D., ebenso wie die School of Physiology mit Arturo Rosenblueth, M.D., einem Pionier der Kybernetik und Gründer des Center of Scientific Research and Advanced Studies, das internationalen Status hat. Im Jahr 1950 wurde die pädiatrische Kardiologie zu einer anerkannten Stärke in Mexiko aufgrund der Kenntnisse von Jorge Soberon, M.D. und Jorge Espino-Vela, M.D., und den revolutionären Studien zur embryologischen Entwicklung des Herzens von Maria de la Cruz, M.D.

De la Cruz war der erste, der zeigte, dass die Ventrikel anatomische Einheiten sind, nicht embryologische Einheiten. De la Cruz ist vielleicht am besten für ihre eleganten In-vivo-Mapping-Studien bekannt. Ihre Untersuchungen mit Ricardo Moreno, M.D., zeigten, dass das röhrenförmige Herz nur aus den primordialen apikalen, trabekulären Regionen beider Ventrikel besteht und dass an beiden Enden dieses primitiven Herzens neue Zellpopulationen hinzugefügt werden. Obwohl de la Cruz Morphologin war, konzentrierte sich das letzte Jahrzehnt ihres Lebens auf die Integration der morphologischen Veränderungen mit den zugrunde liegenden molekularen und biochemischen Mechanismen, in Zusammenarbeit mit Roger Markwald, MD, von MUSC, der einer der besten in der Branche ist sein Feld. Gemeinsam schrieben sie das Buch „Lebendige Morphogenese des Herzens“.

Das Instituto Nacional de Cardiologia war das erste Krankenhaus des Landes, das den Gore Helex Septal Occluder für den Transkatheterverschluss eines Vorhofseptumdefekts einsetzte. Abteilungsleiter Dr. Carlos Zabal und Dr. Jose Garcia Montes erreichten im März das Meilensteinverfahren.

Das Nationale Institut für Kardiologie von Mexiko ist ein wegweisender Führer auf dem Gebiet der Kardiologie mit Leistungen, die nationale und ausländische Kardiologen von internationalem Rang angezogen haben.


Danksagung

Wir danken E. Cundliffe für Diskussionen und die kritische Lektüre dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch das National Research Laboratory (NRL)-Programm (R0A-2008-000-20030-0) und das Global Frontier Program for Intelligent Synthetic Biology durch die National Research Foundation of Korea (NRF), NRF-Stipendien (2010-0001487 und 2010-0028193) finanziert vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie und dem Programm des Meeres- und Extremgenomforschungszentrums des Ministeriums für Land, Verkehr und maritime Angelegenheiten, Republik Korea. J.W.P. dankt dankbar für ein Stipendium (20100623) des Technologieentwicklungsprogramms für Land- und Forstwirtschaft, Ministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Fischerei, Republik Korea.


Geschichte der Antibiotika

Die Geschichte der Antibiotika kann in zwei Segmenten wie folgt beschrieben werden:

Frühe Geschichte

  • Griechen und Inder verwendeten Schimmelpilze und andere Pflanzen zur Behandlung von Infektionen.
  • In Griechenland und Serbien wurde schimmeliges Brot traditionell zur Behandlung von Wunden und Infektionen verwendet.
  • Warme Erde wurde in Russland von Bauern verwendet, um infizierte Wunden zu heilen.
  • Sumerische Ärzte gaben Patienten Biersuppe gemischt mit Schildkrötenpanzern und Schlangenhäuten.
  • Babylonische Ärzte heilten die Augen mit einer Mischung aus Froschgalle und Sauermilch.
  • Die srilankische Armee verwendet Ölkuchen (Süßfleisch), um sowohl als Trockenmittel als auch als antibakteriell zu dienen.

Jahr Herkunft Beschreibung
1640 England John Parkington empfahl in seinem Buch über Pharmakologie die Verwendung von Schimmelpilzen zur Behandlung
1870 England Sir John Scott Burdon-Sanderson beobachtete, dass mit Schimmel bedeckte Kulturflüssigkeit keine Bakterien produzierte
1871 England Joseph Lister experimentierte mit der antibakteriellen Wirkung auf menschliches Gewebe an dem, was er Penicillium glaucium nannte
1875 England John Tyndall erklärte der Royal Society die antibakterielle Wirkung des Penicillium-Pilzes
1877 Frankreich Louis Pasteur postulierte, dass Bakterien andere Bakterien (Milzbrandbazillen) abtöten könnten.
1897 Frankreich Ernest Duchesne heilte mit Schimmel (Penicillium glaucium) infizierte Meerschweinchen von Typhus
1928 England Sir Alexander Fleming entdeckte das Enzym Lysozym und das Antibiotikum Penicillin aus dem Pilz Penicillium notatum
1932 Deutschland Gerhard Domagk entdeckte Sulfonamidochrysoidin (Prontosil)
In den 1940er und 50er Jahren wurden Streptomycin, Chloramphenicol und Tetracyclin entdeckt und Selman Waksman benutzte den Begriff "Antibiotika", um sie zu beschreiben (1942)

Sir Alexander Fleming

Der schottische Biologe Sir Alexander Fleming definierte mit seinen Entdeckungen des Enzyms Lysozym (1921) und des Antibiotikums Penicillin (1928) neue Horizonte für moderne Antibiotika. Die Entdeckung von Penicillin aus dem Pilz Penicillium notatum perfektionierte die Behandlung bakterieller Infektionen wie Syphilis, Gangrän und Tuberkulose. Mit seinen Schriften zu den Themen Bakteriologie, Immunologie und Chemotherapie hat er auch einen großen Beitrag zur medizinischen Wissenschaft geleistet.

Alexander Fleming wurde am 6. August 1881 in Loudon, Schottland, in einer Bauernfamilie geboren. Nachdem seine Familie 1895 nach London gezogen war, setzte er seine Ausbildung am Regent Street Polytechnic fort. Er trat der St. Mary's Medical School bei und wurde wissenschaftlicher Assistent des renommierten Sir Almroth Wright, nachdem er sich 1906 mit Auszeichnung qualifiziert hatte. Er schloss seinen Abschluss (MBBS ) mit Goldmedaille 1908 von der University of London und lehrte bis 1914 in St. Mart. Er diente als Kapitän während des Ersten Weltkriegs und arbeitete in Schlachtfeldkrankenhäusern in Frankreich. Nach dem Krieg kehrte er 1918 nach St. Mary zurück und wurde 1928 zum Professor für Bakteriologie gewählt.

Die Entdeckung von Antibiotika

"Man findet manchmal, was man nicht sucht"

(Herr Alexander Fleming)

Seine Forschungen und Studien während seiner militärischen Karriere inspirierten ihn 1921 zur Entdeckung eines natürlich antiseptischen Enzyms, das er Lysozym nannte.Diese Substanz war in Geweben und Sekreten wie Schleim, Tränen und Eiweiß vorhanden, hatte jedoch keine große Wirkung auf die stark schädlichen Bakterien. Sechs Jahre später entdeckte er durch einen intelligenten Zufall das Penicillin. Es war im Jahr 1928, als er während eines Experiments mit dem Influenzavirus beobachtete, dass ein häufiger Pilz, Penicillium notatum, Bakterien in einer Staphylokokken-Kulturplatte zerstört hatte. Bei weiteren Untersuchungen stellte er fest, dass Schimmelpilzsaft eine bakterienfreie Zone entwickelt hatte, die das Wachstum von Staphylokokken hemmte. Dieser neu entdeckte Wirkstoff war auch bei bis zu 800-facher Verdünnung wirksam. Er nannte es Penicillin.

Er wurde 1944 zum Ritter geschlagen und erhielt 1945 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin für seine außergewöhnlichen Leistungen, die die medizinischen Wissenschaften revolutionierten.

Wie wirken Antibiotika?

Verschiedene Arten von Antibiotika wirken auf eine der folgenden zwei Arten:

    Ein bakterizides Antibiotikum tötet die Bakterien im Allgemeinen ab, indem es entweder die Bildung der Zellwand des Bakteriums oder seinen Zellinhalt stört.

Penicillin, Daptomycin, Fluorchinolone, Metronidazol, Nitrofurantoin und Cotrimoxazol sind einige Beispiele für bakterizide Antibiotika.

Einige bakteriostatische Antibiotika sind Tetracycline, Sulfonamide, Spectinomycin, Trimethoprim, Chloramphenicol, Makrolide und Lincosamide.


Schau das Video: Wie wirken Antibiotika?! (Januar 2022).