Information

Wie sollen die ersten Brustdrüsen funktioniert haben?


Ich bin zufällig auf ein Buch (nicht über Biologie) gestoßen, das diesen Text enthält:

Eine lebensverändernde Geburt ereignete sich auf dem Planeten vor etwa 190 Millionen Jahren [… ] die erste winzige, spitzbübische Kreatur brachte ein Kind zur Welt und begann, ihre Jungen zu säugen. […] dieses pelzige kleine Säugetier verkörperte einen großen Sprung in der biologischen Evolution

Die Beschreibung ist schön dramatisch, aber für mich stimmt es nicht. Obwohl ich weiß, dass die Evolution wahrscheinlich nicht so allmählich war, wie es in High-School-Büchern dargestellt wird, ist der Gedanke, dass ein Nicht-Säugetier eine Tochter mit voll funktionsfähigen Brustdrüsen geboren hat, die ihre Jungen aktiv gesäugt hat, ein bisschen zu viel für mich, um es zu schlucken. Für andere Körpersysteme habe ich Geschichten gelesen, wie sie nach und nach entstanden sind, zum Beispiel die ältesten Arten mit ein paar Nervenzellen, dann neue mit einem ganzen nervösen "Netzwerk" mit einigen Ganglien, bevor echte Gehirne entstanden. Auf ähnliche Weise entwickelten sich Würmer mit einem Fleck lichtempfindlicher Zellen auf der Haut zu Tieren mit Augen. Ich weiß, dass Schnabeltiere Brustdrüsen ohne Brustwarzen haben, aber vermutlich sind auch sie schon viel ausgeklügelter als die ersten Brustdrüsen.

Wie sollen also die Proto-Brustdrüsen ausgesehen haben? Haben sie sich de novo speziell zum Füttern von Babys entwickelt oder waren es vielleicht umfunktionierte Schweißdrüsen oder so? Wie sollen sie funktioniert haben?


Die Produktion von Flüssigkeiten zur Ernährung der Nachkommen hat sich in mehreren Abstammungslinien getrennt entwickelt, Säugetiere haben es einfach weiter gebracht als jede andere Gruppe. Es ist ziemlich leicht zu erkennen, wie es sich entwickeln könnte. Jede Möglichkeit, auch nur Spurennährstoffe oder Nahrung für junge Menschen bereitzustellen, wird bei Organismen, die bereits mit der Kindererziehung beschäftigt sind, einen Vorteil haben. es bedeutet, dass die Jungen seltener Raubtieren ausgesetzt werden.

Brustdrüsen sind modifizierte Schweißdrüsen.

Monotreme haben keine Brustwarzen, sondern eine Ansammlung von Brustdrüsen auf einem Hautfleck. die Jungen müssen die Milch einer Haarbüschel saugen.

Der genaue Ablauf der Laktation ist nicht bekannt, da die Laktation keine fossilen Beweise hinterlässt.


Quellen:

Lefèvre, C. M., Sharp, J. A. und Nicholas, K.R., 2010. Evolution der Laktation: alter Ursprung und extreme Anpassungen des Laktationssystems. Jährliche Überprüfung der Genomik und Humangenetik, 11, S. 219-238.

Capuco, A. V. und Akers, R. M., 2009. Der Ursprung und die Entwicklung der Laktation. Zeitschrift für Biologie, 8(4), S.37.


Signalwege, die an der frühen Morphogenese der Brustdrüsen und Brustkrebs beteiligt sind

Die Bestimmung des Schicksals der Brustepithelzellen erfolgt während der Embryogenese, wenn sich die Zellen zur Bildung der Brustanlage zusammenballen. Innerhalb der embryonalen Brustknospe existiert eine Population von Epithelzellen, die sich anschließend zu einem das Stromakompartiment ausfüllenden Gangbaum vermehren und nach der Geburt nach der Geburt Milch produzieren können. Anschließend können diese Strukturen umgebaut und nach dem Absetzen in einen basalen Zustand zurückversetzt werden, bevor sie sich in zukünftigen Schwangerschaften regenerieren. Die Plastizität der Brustepithelzelle und ihre Reaktionsfähigkeit auf Hormonrezeptoren erleichtern diese erstaunliche biologische Leistung, aber eine abweichende Signalübertragung kann auch unbeabsichtigte Folgen in Form von häufigen Malignomen haben. Diese enge Verbindung widerspiegelt, wurde eine beträchtliche Anzahl von Signalwegen sowohl an der Brustdrüsen-Morphogenese als auch an der Karzinogenese beteiligt.

Zitat: Howard B, Ashworth A (2006)Signalwege, die an der frühen Brustdrüsen-Morphogenese und an Brustkrebs beteiligt sind. PLoS Genet 2(8): e112. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.0020112

Editor: Elizabeth M. C. Fisher, University College London, Vereinigtes Königreich

Veröffentlicht: 25. August 2006

Urheberrechte ©: © 2006 Howard und Ashworth. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium gestattet, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben werden.

Finanzierung: Die Arbeit in unserem Labor wird vom Breakthrough Breast Cancer Research Center unterstützt.

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.


Stammzellen und die sich entwickelnde Brustdrüse

Die Brustdrüse unterliegt im Laufe des Lebens dynamischen Veränderungen. Bei der Maus beginnen diese mit einer anfänglichen Morphogenese der Drüse im Embryo in der mittleren Schwangerschaft, gefolgt von hormonell regulierten Veränderungen während der Pubertät und später im Erwachsenenalter. Die erwachsene Brustdrüse enthält eine Hierarchie von Zelltypen mit unterschiedlichen Potenzialen zur Selbsterhaltung und Differenzierung. Dazu gehören Zellen, die in vivo vollständige, funktionelle Brustdrüsen produzieren können und die Tochterzellen mit dem gleichen bemerkenswerten regenerativen Potenzial enthalten, sowie Zellen mit eingeschränkterer klonogener Aktivität in vitro. Hier überprüfen wir, wie die Anwendung von In-vitro- und In-vivo-Methoden zur Quantifizierung dieser Zellen im adulten Brustgewebe auf fetale Brustzellen es ermöglicht hat, einige Tage vor der Geburt die ersten Zellen zu identifizieren, die die funktionellen Kriterien von transplantierbaren, isolierten Bruststammzellen erfüllen. Danach nimmt die Zahl dieser Zellen schnell zu. Populationen, die diese fötalen Stammzellen enthalten, weisen Wachstums- und Genexpressionsprogramme auf, die sich von ihren erwachsenen Gegenstücken unterscheiden, aber für bestimmte Arten von Brustkrebs charakteristische Signaturen aufweisen. Solche Beobachtungen verstärken die zunehmenden Hinweise auf wichtige Unterschiede zwischen gewebespezifischen fötalen und adulten Zellen mit Stammzelleigenschaften und unterstreichen die Vorzüge der Untersuchung ihrer molekularen Grundlagen.

Dies ist eine Vorschau von Abonnementinhalten, auf die Sie über Ihre Institution zugreifen können.


Ergebnisse

Cyclin E transgene Mäuse, transgene Zygosität und Expression

Sowohl die Cyclin E- als auch die hyperstabilen Cyclin E-T380A-Allele (im Folgenden T380A) sind Single-Locus-Insertionen, die unabhängig vom p53-Locus vererbt werden, der sich auf dem Maus-Chromosom 11 befindet, und nicht geschlechtsgebunden sind. Der Genotyp veränderte weder das Alter der Geschlechtsreife noch die Wurfgröße. Alle hier berichteten Mauslinien waren entweder homozygot oder nullizygot am Transgen-Locus und Wildtyp- oder heterozygot am p53-Locus. Diese wurden als Wildtyp, CycE, T380A, p53 +/– , p53 +/– CycE und p53 +/– T380A bezeichnet. Die Expression der Transgene wurde immunhistochemisch in den Kernen des Brustepithels nachgewiesen, jedoch nicht in anderen untersuchten Geweben (alle thorakalen und abdominalen Eingeweide, zentrales und peripheres Nervengewebe, hämatopoetisches Gewebe, Skelettmuskulatur und integumentäre Daten nicht gezeigt). Jedoch waren Spuren der Expression des T380A-Allels in Lunge und Leber nach langen Immunoblot-Expositionen nachweisbar (≥ 1000-fach weniger Expression als in der Brustdrüse in der Mitte der Laktation durch Titration auf Immunoblot-Daten nicht gezeigt).

Wir haben zuvor gezeigt, dass ein Cyclin-E-Transgen bei Mäusen mit einer Hyperplasie im Brustdrüsenepithel assoziiert ist, die gleichzeitig mit seiner Expression unter dem auf Prolaktin ansprechenden β-Lactoglobulin-Promotor (BLG). Dieses Phänomen ist vorübergehend, tritt in den Epithelien während des laktogenen Zyklus auf, manifestiert sich anfänglich im letzten Drittel der Trächtigkeit und dauert an, bis der Wurf 4 Wochen nach der Geburt entwöhnt wird. An diesem Punkt durchlaufen die Brustepithelien eine Involution und die hyperplastischen Epithelien werden in diesen Prozess einbezogen (Bortner und Rosenberg, 1997). Bei Standard-Hämatoxylin- und Eosin-Färbung erschien Hyperplasie in den Epithelien der mittleren Laktation (2 Wochen nach der Geburt) bei Mäusen bei T380A-transgenen Mäusen im Allgemeinen weiter verbreitet als bei denen mit dem CycE-Transgen, aber nicht schwerer. In der Milchdrüse in der Mitte der Laktation wurde das T380A-Transgen stark exprimiert mit einer geringeren Expression des CycE-Transgens ( 1a ). Die Titration des T380A-Signals gegen das von CycE-Mäusen zeigte eine etwa 10-fach höhere Expression ( 1b ). Gleichzeitig mit der Expression in der Brustdrüse war die Aktivität der Transgen-assoziierten (humanen Cyclin E)-Kinase in Mäusen mit dem T380A-Allel stark erhöht ( 1c ). Die mit dem CycE-Allel assoziierten Kinasespiegel waren jedoch nicht signifikant über den intrinsischen Hintergrund des Assays erhöht.

Transgenexpression und transgenabhängige Kinaseaktivität in den Milchdrüsen der mittleren Laktation (2 Wochen nach der Geburt). (ein) Immunblot-Analyse durch 15% PAGE von Proteinextrakten aus Wildtyp-, Cyclin E- und T380A-Brustdrüsen mit humanem Cyclin E-spezifischem monoklonalem Antikörper HE12. (B) Die Titration der T380A-Transgen-Expression gegen die in den Cyclin E-Mäusen zeigt, dass die Steady-State-Expression in den T380A-Mäusen ungefähr 10-fach höher ist. (C) Cyclin E-abhängige Kinaseaktivität ist bei T380A-Mäusen höher. Extrakte aus Milchdrüsen in der Mitte der Laktation nach 2 Wochen wurden mit humanem Cyclin E-spezifischem HE172-IgG immunpräzipitiert. Die Histon H1-Phosphorylierung in Gegenwart von radioaktiv markiertem ATP war bei T380A-Mäusen größer als bei Wildtyp-Mäusen (ohne das humane Cyclin E-Transgen), während bei den Cyclin E-Mäusen die transgenabhängige Kinaseaktivität nicht über den Hintergrund erhöht war. Die Kinaseaktivität in p53 +/– T380A-Mäusen war mit der in den T380A-Mäusen vergleichbar. –ve- und +ve-Kontrollen repräsentieren kein hinzugefügtes Protein bzw. rekombinanten CyclinE/Cdk2-Extrakt aus SF9-Zellen.

Das Tumorspektrum in p53+/−-Mäusen wird durch die Cyclin-E-Transgene nicht beeinflusst

Das Spektrum der in p53 +/– -Mäusen beobachteten Tumoren ist gut etabliert. Wir beobachteten ein ähnliches Tumorspektrum wie in veröffentlichten Berichten (Donehower et al., 1992, Jacks et al., 1994). Bei multiparen p53 +/– -Mäusen beobachteten wir eine moderate Rate von Mammakarzinomen, 7% (3/45). Das Tumorspektrum bei p53 +/– -Mäusen mit entweder T380A- oder CycE-Transgen war ähnlich (Tabelle 1) mit Ausnahme einer geringen Häufigkeit von bronchiolären/alveolären Läsionen in den Lungen von Mäusen, die das T380A-Transgen trugen. Diese Zufallsbefunde waren jedoch kleine (<3 mm) einzelne Läsionen, die während der Autopsie nach 18 Monaten beobachtet wurden. Repräsentative Schnitte von Nicht-Mammatumoren (einschließlich der Lungenläsionen) waren durchweg negativ für die Transgen-Expression, aber positiv für endogenes Maus-Cyclin E (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expression von Cyclin E unter der Kontrolle des BLG-Promotors die Bildung von Nicht-Brust-Tumoren nicht signifikant fördert.

P53-Heterozygotie wirkt synergistisch mit dem T380A-Allel, um die Tumorentstehung der Brustdrüse zu fördern und die Lebenserwartung zu verringern

Die p53 +/– T380A-Mäuse zeigten eine leichte, aber signifikante Verringerung der Lebenserwartung im Vergleich zu p53 +/– -Mäusen (Abbildung 2a P<0,005, Log-Rank-Test). Obwohl ungefähr 25 % der p53 +/– und 70 % der T380A-Mäuse nach 1,5 Jahren tumorfrei waren, erreichte kein p53 +/– T380A-Tier dieses Alter tumorfrei (Tabelle 1). Aufgrund der erhöhten Anzahl von Brusttumoren war eine gewisse Verringerung der Lebenserwartung zu erwarten.P= 0,212 Log-Rank-Testdaten nicht gezeigt).

p53-Heterozygotie ist synergistisch mit dem T380A-Cyclin-E-Allel bei der Förderung der Brusttumorentstehung und der Verringerung des Überlebens, verringert jedoch die Tumorlatenz nicht signifikant. (ein) Das T380A-Cyclin-E-Allel verringert das Überleben (linkes Feld), die auf die Tumorentstehung der Brust zurückzuführen ist. p53 +/– T380A-Mäuse, die das Transgen exprimieren (rechte Tafel) haben eine leichte, aber statistisch signifikante Abnahme des Überlebens (P<0,005 Log-Rank-Test) im Vergleich zu den nicht-transgenen Kontrollen (p53 +/– ). Der Unterschied ist auf eine erhöhte Rate der Mammatumorogenese zurückzuführen (siehe Text). (B). (C) Die Latenz der Brusttumorentstehung ist bei p53T380A-Mäusen leicht verringert, erreichte jedoch keine statistische Signifikanz. Jeder Kreis repräsentiert den Zeitpunkt des Tötens und vertikale Balken repräsentieren Mittelwerte.

Obwohl das Tumorspektrum bei p53 +/– -Mäusen mit oder ohne Cyclin E-Transgene unverändert war, war die Häufigkeit, mit der Mammatumoren beobachtet wurden, in Gegenwart des hyperstabilen Cyclin E-Transgens deutlich verändert. Bei p53 +/– -Mäusen ohne Transgen wurde bei 7% (3/45) eine Brusttumorentstehung beobachtet. Bei p53 +/– -Mäusen mit dem Wildtyp-Cyclin E-Transgen war die Tumorpenetranz unverändert bei 6% (2/32), während bei Mäusen mit dem hyperstabilen T380A-Allel die Penetranz auf 54% (30/56) erhöht war (Abbildung 2b). Dieser Anstieg der Tumorpenetranz war synergistisch, da er signifikant größer war als die Addition der in den Kontrolllinien beobachteten Frequenzen (P<0.001 Fishers exakter Test und χ 2-Test). Der synergistische Effekt war noch größer, wenn man bedenkt, dass drei der p53 +/– T380A-Mäuse zwei unabhängige Brusttumore entwickelten, was ein normalisiertes Verhältnis von 7:12:59 ergibt (p53 +/– :T380A:p53 +/– T380A). Die Brusttumorhäufigkeit bei den für das hyperstabile Allel transgenen Mäusen ohne p53-Mutation betrug lediglich 12 % (4/34). Die Brusttumorlatenz war bei p53 +/– T380A-Mäusen leicht verringert, erreichte jedoch keine Signifikanz (ANOVA P<0.28 Abbildung 2c), möglicherweise aufgrund der geringen Anzahl von Tumoren bei Mäusen anderer Genotypen.

Alle Mammatumoren waren intermediäre bis hochgradige Karzinome (Abbildung 3) mit hohen Mitoseraten, erheblichen Kernatypien, schlechter Azinusdifferenzierung und Nekrosebereichen. Gewöhnlich wurde eine lokale Invasion der Haut und/oder Muskulatur beobachtet. Trotz des offenkundigen malignen biologischen Verhaltens wurden bei der routinemäßigen histologischen Untersuchung von Lunge, Leber und Knochenmark jedoch keine hämatogenen Metastasen beobachtet. In mehreren Fällen wurde eine lymphatische Dissemination festgestellt, die jedoch im Allgemeinen selten beobachtet wurde. In den zervikalen Brustdrüsen traten mehr Tumore auf, als erwartet wurde, da die zervikalen Brustdrüsen nur 2 der 10 Brustdrüsen der Maus ausmachen. Diese zervikalen Mammatumoren waren auch mit einer kleineren durchschnittlichen Wurfgröße verbunden (Daten nicht gezeigt). Viele der bösartigen Neubildungen außerhalb der Brustdrüsen zeigten neben einer lokalen Invasion sowohl eine hämatogene als auch eine lymphatische metastatische Ausbreitung.

Histologie, immunhistochemische und Immunoblot-Analyse der Transgenexpression in Brusttumoren. (ein) T380A-Expression in den Kernen von Mammaepithelien in der Mitte der Laktation (DAB-Braunfärbung). (B) T380A-Expression in der epithelialen Komponente eines Brusttumors, der in einer p53 +/– T380A-Maus entsteht. (C) Keine Färbung in einem Tumor einer p53 +/– T380A-Maus, aber mit einer ablumenalen immunreaktiven Zellpopulation in angrenzenden Gangepithelien. (D und e) Starke immunreaktive Färbung einiger Epithelien in Brusttumoren von p53 +/– T380A- bzw. T380A-Mäusen, jedoch mit negativer Färbung in Bereichen mit Plattenepitheldifferenzierung (Pfeile). (F) Negative Färbung von Mitosefiguren (Pfeilspitzen) innerhalb eines im Allgemeinen transgenen immunpositiven Tumors in einer p53 +/– T380A-Maus. Der Einschub zeigt die Vergrößerung einer Metaphase-Zelle. Die Originalvergrößerung für jedes Panel ist in der unteren rechten Ecke angegeben. (g) Western-Analyse von Brusttumoren, die eine gute Korrelation mit der immunhistochemischen Bewertung der Transgenexpression zeigt. + und – sind positive bzw. negative Kontrollen. ++ starke Färbung (≥50% der Epithelkomponente), + schwache Färbung <50% der Epithelkomponente, − negative Färbung (mit einigen Komponenten der unbeteiligten duktalen Epithelfärbung positiv). Beachten Sie eine stärkere Expression in einigen Tumoren als in der Brustdrüse der mittleren Laktation (insgesamt), obwohl variable Blut-, Stroma- und Milchproteine ​​mit regionalen Variationen der Expression einen absoluten Vergleich ausschließen.

Brusttumore, insbesondere bei p53 +/– T380A-Mäusen, waren aggressive schnell wachsende Läsionen. Typischerweise wurde eine Größe von 1 cm innerhalb von 2–8 Tagen nach der ersten Entdeckung der Läsion erreicht. Darüber hinaus wiesen mehrere der p53 +/– T380A-Läsionen außergewöhnlich hohe Mitoseindizes auf, 20–30 Mitosefiguren pro × 40 Objektivfeld, mit häufigen Nekrosebereichen. Im Gegensatz dazu wurden Läsionen von T380A- oder p53 +/–-Mäusen durch moderatere Mitoseraten von 4–20 Ziffern pro × 40-Objektivfeld charakterisiert (Tabelle 2). Obwohl festgestellt wurde, dass mehrere Mäuse mehrere primäre Läsionen in verschiedenen Geweben aufwiesen, entwickelten sich mehrere Mammaläsionen nur bei p53 +/– T380A-Mäusen (3/56 jede Maus wurde jedoch als ein einzelner Datenpunkt für die Penetranzanalyse gezählt). Bei den wenigen p53 +/– T380A-Mäusen der F1-Generation, bei denen jede Maus am Ort der Transgen-Insertion heterozygot ist, wurde eine Brusttumorentstehung mit einer äquivalenten Rate von 60 % (3/5) beobachtet, was darauf hindeutet, dass eine Hemizygotie am Transgen-Locus ausreichend sein könnte für volle Penetranz.

Histologisch bestanden die meisten Mammatumoren aus dichten Schichten oder Nestern neoplastischer Zellen, die normalerweise mit einer feinen Stromakomponente durchsetzt waren (Abbildung 3). Die überwiegende Mehrheit der Mammaläsionen waren azinäre Adenokarzinome, obwohl viele Bereiche mit Plattenepithelmetaplasie mit unterschiedlichem Grad an Keratinablagerung aufwiesen. Die Diagnose eines Plattenepithelkarzinoms ohne offenkundige azinäre Differenzierung war selten, wurde jedoch in jedem der p53 +/– , p53 +/– T380A- und T380A-Genotypen einmal erfasst. Nur eine azinäre Läsion (p53 +/− T380A) und zwei der Plattenepithelkarzinome (1 p53 +/− und 1 T380A) wurden als mittelgradig eingestuft. Alle übrigen Läsionen wurden als hochgradig eingestuft. Zwei Fälle von Karzinom vor Ort (beide hochgradig) wurden bei p53 +/– T380A-Mäusen bei der Autopsie beobachtet. Diese wurden bei den anderen Genotypen nicht beobachtet.

Nur vier p53 +/– T380A-Mäuse mussten vor dem Alter getötet werden, in dem der erste Brusttumor festgestellt wurde. Diese Mäuse boten jedoch die Möglichkeit, in der Zeit zwischen der letzten Schwangerschaft und der relativ langen Latenz bis zur tastbaren Tumorbildung nach präneoplastischen Mammaläsionen zu suchen. Von diesen vier Mäusen entwickelten zwei im Alter von 6,8 und 9,8 Monaten ein Thymuslymphom, eine ein Osteosarkom und die vierte wurde aufgrund einer schweren Dermatitis getötet. Die Immunhistochemie zeigte das Vorhandensein einiger immunreaktiver Zellen des humanen Cyclin E, die ablumenal zu den Gängen aller vier Mäuse lokalisiert waren (siehe unten). Bei einer der Mäuse mit Lymphom wurde ein Herd von alveolärer Hyperplasie festgestellt, bei dem sich das Epithel positiv auf die Expression des T380A-Transgens färbte (Fig. 3c).

Die Darstellung der Tumorinzidenz bei Mäusen, die für neoplastische Läsionen in mehreren Organsystemen anfällig sind, kann problematisch sein, um sicherzustellen, dass die entsprechenden Schlussfolgerungen gezogen werden. Es ist daher wichtig, zwei Beobachtungen zu klären, die unsere Ergebnisse nicht wesentlich beeinflussen. Erstens scheint die Inzidenz von Osteosarkomen bei p53 +/– T380A-Mäusen im Vergleich zu den anderen p53 +/– tragenden Genotypen verringert zu sein (Tabelle 1). Dies ist auf die frühere Darstellung von Mammaläsionen zurückzuführen und unterstreicht damit die Osteosarkom-Inzidenz aufgrund der längeren Latenz dieser Läsionen. Zweitens zeigen die Überlebenskurven in ähnlicher Weise, dass die p53 +/– T380A-Mäuse eine signifikant verringerte Lebenserwartung im Vergleich zu den p53 +/– -Mäusen hatten, die kein Transgen trugen. Während dies jedoch fast ausschließlich auf die erhöhte Inzidenz neoplastischer Mammaläsionen zurückzuführen ist, war die ähnliche Überlebenskurve der p53 +/– CycE-Mäuse fast ausschließlich auf Nicht-Mamma-Neoplasmen zurückzuführen und erreichte im Vergleich zu p53 + . keine Signifikanz /− Genotyp.

Mammatumoren zeigen häufigen Verlust der p53-Heterozygotie und konstitutiver Expression des Cyclin E-Transgens

Im Gegensatz zu einigen Berichten über die Retention des Wildtyp-Allels in 50% der Tumoren, die bei p53 +/– -Mäusen unter 18 Monaten auftreten (Venkatachalam et al., 1998), bewerteten wir p53 LOH als häufigeres Ereignis. Der Verlust der p53-Heterozygotie wurde in Tumorextrakten durch Southern-Analyse (Fig. 4) und eine Reihe von Multiplex-PCR-Reaktionen bestimmt. Eindeutige p53 LOH (≥50% Exon IV Signalabnahme siehe experimentelle Verfahren) wurde bei 100% (3/3) der p53 +/– Mäuse, 100% (2/2) p53 +/– CycE Mäusen und 93% ( 26/28) von p53 +/– T380A-Mäusen (Tabelle 2). Von den vier T380A-Mäusen, die Brusttumore entwickelten, waren beide Wildtyp-p53-Allele in zwei Fällen (50% 2/4) nicht nachweisbar, wie durch Southern-Analyse bestimmt. In einem weiteren Fall gab es einen mehrdeutigen Verlust (ungefähr 50%, was wahrscheinlich den Verlust eines Allels darstellt), aber der vierte Fall hatte eine eindeutige Retention von p53 durch Southern-Blot. Tatsächlich wurde in diesem späteren Fall das Wildtyp-Allel offensichtlich sogar nach einer seriellen Passage von Zellen, die aus dem Tumor kultiviert wurden, beibehalten ( 4b ). Die Exposition gegenüber 5 Gy ionisierender Strahlung, die die p21-Expression in 10T . robust induzierte1/2 Zellen konnten in diesen Zellen keine p21-Expression induzieren (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass p53 durch einen anderen Mechanismus als den genomischen Verlust des TRP53 Ort. Das Wildtyp-p53-Allel fehlte ausnahmslos in Zellen, die von Brustläsionen in p53-heterozygoten Mäusen stammten. Bei Tumoren, die das Wildtyp-p53-Allel behalten, können wir eine p53-Inaktivierung oder einen Funktionsgewinn durch kleine genetische Läsionen wie Punktmutationen nicht ausschließen, obwohl diese Daten darauf hindeuten, dass die funktionelle Inaktivierung in der überwiegenden Mehrheit der Brustläsionen durch den Verlust von a signifikante Chromosomenregion oder ein ganzes Chromosom.

LOH von p53 Southern-Analyse und PCR. (ein) Repräsentative Southern-Analyse von Tumorproben mit Exon IV-Sonde, die der Mutante (mut), Wildtyp (wt) und Pseudogen (Ψ) gemeinsam ist, und densitometrische Quantifizierung. Beachten Sie, dass die meisten Tumoren einen eindeutigen Verlust der Heterozygotie mit einem nicht nachweisbaren Wildtyp-Allel aufweisen. Spuren 1 und 7 enthalten Kontroll-p53 +/– -DNA, die aus gesunden Lebern extrahiert wurde post mortem. Spuren 3, 6 und 12 zeigen mehr zweideutige LOH, aber immer noch signifikant niedriger als das mutierte Allel. (B) Repräsentative Southern-Analyse von Tumor-abgeleiteten Zelllinien, die klares p53-LOH in allen getesteten Linien zeigen, die von p53 +/– T380A-Mäusen stammen, während beide Kopien in einer von einer T380A-Maus abgeleiteten Linie (Spur 4) erhalten zu sein scheinen. (C) Repräsentative Multiplex-PCR-Reaktion, die die Deletionsregion überspannt. Man beachte häufiges p53-LOH mit eindeutiger Retention des Wildtyp-Allels in nur zwei Tumoren von p53 +/– T380A-Mäusen (Spuren 5 und 6) und zweideutigem Verlust in einem (Spur 29, die ebenfalls besser differenziert ist). (D) Human-Cyclin-E-Immunhistochemie eines Tumors mit einem relativ hohen Stroma-Gehalt (entsprechend Bahn 6 in Tafel a und Bahn 29 in Tafel c). Originalvergrößerung × 400.

Wir hatten zuvor eine erhöhte Expression des Wildtyp-Human-Cyclin-E-Transgens in Tumoren beobachtet, die in Gründer-transgenen Mäusen entstanden (Bortner und Rosenberg, 1997). Wir analysierten daher Brusttumore auf Transgenexpression durch Immunhistochemie und durch Immunoblot-Analyse. Die meisten der von transgenen Linien abgeleiteten Tumoren waren positiv für die Transgenexpression (Tabelle 2 und Fig. 3). Dies war etwas unerwartet, da diese Mäuse weder trächtig waren noch säugend waren. Die Einstufung der immunhistochemischen Färbung (Abbildung 3g) korrelierte gut mit der quantitativeren Immunoblot-Analyse. In der überwiegenden Mehrheit der Tumoren, die in Linien mit dem T380A-Allel entstanden, waren mehr als 50 % der Tumorepithelkomponente humanes Cyclin E immunreaktiv (Bewertung ++). Bei den Tumoren, bei denen zwischen 10 und 50 % der epithelialen Komponente positiv getestet wurden (Bewertung +), wurden verschiedene Färbungsmuster beobachtet, obwohl die Immunreaktivität in Zellen mit Plattenepithelmetaplasie, in der Mitose oder in der Nähe von Nekrosebereichen gering oder nicht vorhanden war. Tumoren, denen die morphologische Diagnose eines Plattenepithelkarzinoms zugeordnet wurde, wurden negativ getestet.

Die Inzidenz von Brusttumoren hängt mit der Parität bei Cyclin E-transgenen Mäusen zusammen

Weitere Beweise für die Verbindung von Cyclin E-Deregulierung und Tumorentstehung sind in der Beziehung zwischen der Tumorpenetranz und der Anzahl der Schwangerschaften zu sehen, die jede Frau durchmachte (und damit zu Ausbrüchen der Transgeninduktion). Obwohl Anstrengungen unternommen wurden, jede Frau auf zwei Schwangerschaften zu beschränken, war eine dritte Schwangerschaft, die aus der Kopulation während des postpartalen Östrus resultierte, relativ üblich. Folglich hatten mehrere Mäuse jedes Genotyps tatsächlich drei Würfe und in zwei Fällen vier Würfe. Wir konnten diese Daten mit den Tumorentstehungsraten bei den wenigen Weibchen kombinieren, die aus der ursprünglichen Analyse ausgeschlossen wurden, da sie nur einen einzigen Wurf hatten, um eine mutmaßliche Beziehung zwischen Parität und Tumorpenetranz zu untersuchen. Wir gingen davon aus, dass, wenn während jeder Schwangerschaft neue genetische Läsionen in Zellen induziert würden, die durch Involution persistieren konnten, dies zu einer Korrelation zwischen der Anzahl der Würfe und der Tumorinzidenz führen könnte. Da diese Analyse kein primäres Studienziel war, war eine statistisch rigorose Analyse der relativ geringen Anzahl von Mäusen mit einer Trächtigkeit und der relativ geringen Anzahl von Kategorien nicht möglich. Es gab jedoch einen Trend zwischen Parität und Brusttumorpenetranz bei jedem der drei transgenen Genotypen, die später Brusttumore entwickelten, wobei die höchste Inzidenz in der Gruppe von Mäusen beobachtet wurde, die die größte Anzahl von Schwangerschaften hatte (Abbildung 5). Darüber hinaus wurde dieser Trend bei den p53 +/– -Mäusen ohne Transgen nicht beobachtet. Obwohl die Parität das Mammakarzinomrisiko bei den p53 +/– -Mäusen ohne das Transgen zu reduzieren scheint, in Übereinstimmung mit den Erwartungen aus Studien an Nagetieren und Menschen (Moon, 1969 Swanson et al., 1995 Thordarson et al., 1995 Hamilton und Mack , 2003), wurde dieser Schutz bei T380A-Mäusen negiert und bei p53 +/– T380A-Mäusen dramatisch aufgehoben.

Die Tumorentstehung der Brustdrüse korreliert mit der Parität bei transgenen Mäusen. (ein). n steht für die Anzahl der Mäuse in jeder Kategorie. (B) Die Brusttumorogenese nimmt mit der Parität in jeder der transgenen Linien zu, jedoch nicht bei p53 +/– -Mäusen, denen ein Cyclin E-Transgen fehlt.

Transgene positive Brustepithelzellen persistieren durch Involution

Die immunhistochemische Analyse von Tumoren hatte ergeben, dass einige unbeteiligte Brustepithelien für humanes Cyclin E immunpositiv waren, was darauf hindeutet, dass entweder das Transgen spät im Leben aktiviert wurde, möglicherweise durch hormonellen Einfluss in der reproduktiven Seneszenz, oder dass eine anhaltende Expression des Transgens in Zellen auftritt, die nach der Rückbildung der Laktation. Um diese Hypothese zu testen, untersuchten wir die Transgenexpression immunhistochemisch bei 6-wöchigen (2 Wochen nach der Laktation) und 8-wöchigen postpartalen Mäusen (zu diesem Zeitpunkt ist die Involution abgeschlossen) und im Brustepithel von Mäusen, die aufgrund früher Brusttumoren oder nicht-neoplastische Ursachen. Während des Involutionsprozesses 6 Wochen nach der Geburt waren noch zahlreiche positive Alveolen vorhanden, obwohl in einigen Gängen eine Subpopulation ablumenaler immunreaktiver Zellen zu sehen war (Abbildung 6a). 8 Wochen nach der Geburt war die Rückbildung abgeschlossen, wie durch Histologie und Ganzmontageanalyse bestimmt. Einige Epithelzellen waren jedoch noch immunreaktiv und eine Subpopulation ablumenaler immunreaktiver Zellen wurde sogar in den kleineren Gängen beobachtet (Abbildung 6c). Diese Subpopulation war bei allen postlaktationalen T380A-tragenden Mäusen offensichtlich und weist darauf hin, dass einige Zellen, in denen genetische Läsionen aufgetreten sein könnten, während der Involution bestehen bleiben. Die ablumenale Lage dieser Zellen deutet darauf hin, dass sie einen multipotenten epithelialen Vorläuferzelltyp (Basalzellen) darstellen könnten, obwohl sie nach vorläufiger Analyse (Daten nicht gezeigt) nicht die Stammzellantigen (SCA-1)-positive Seite darstellen Bevölkerung (Welm et al., 2002). Darüber hinaus färbt sich die ablumenale Nebenpopulation auch bei alten jungfräulichen Mäusen positiv für das Cyclin E-Transgen. Die Brustdrüsen von gealterten jungfräulichen transgenen Mäusen enthalten auch einige positiv färbende luminale Epithelzellen, wenn auch weniger als bei parösen Mäusen. Daher erscheint es wahrscheinlich, dass dem in diesen Studien und anderen Studien verwendeten Schaf-BLG-Promotor Elemente fehlen, die zur Unterdrückung der BLG-Expression in Brustepithel-Vorläuferzellen von Mäusen erforderlich sind.

Expression des Transgens in der postlaktationalen Brustdrüse. (ein und B) 6 Wochen nach der Geburt (2 Wochen nach der Laktation) Cyclin E-Immunhistochemie und Ganzkörperanalyse. Die Involution ist mit dem Vorhandensein eines kleinen Entzündungszellinfiltrats (Pfeile) fast vollständig, aber um einige größere Gänge (Pfeilspitzen) herum ist bereits eine Subpopulation immunreaktiver Basalzellen vorhanden. Beachten Sie, dass HE12 ein monoklonaler Maus-Antikörper ist und die Verwendung eines Anti-Maus-Sekundärantikörpers auf Mausgewebe zu einer Hintergrundfärbung in immunoglobulinreicher Milch, Blutserum und einigen Lymphozyten führt. (C und D) 8 Wochen nach der Geburt (4 Wochen nach der Laktation) Cyclin E-Immunhistochemie und Ganzkörperanalyse. Die Involution ist mit einem Mangel an Entzündungszellen abgeschlossen, aber es verbleibt eine Subpopulation von immunreaktiven Basalzellen (Pfeilspitzen) mit einigen immunreaktiven Alveolarepithelzellen. (e) T380A-Immunhistochemie in der Mitte der Laktation (2 Wochen nach der Geburt) zum Vergleich. (F) Ein immunreaktiver Bereich mit fokaler alveolärer Hyperplasie in einer p53 +/- T380A-Maus, die nach 9,8 Monaten mit einem Lymphom getötet wurde. Die Originalvergrößerung für jedes Panel ist in der unteren rechten Ecke angegeben.

Der frühe Verlust von p53 ist bei Mäusen mit dem T380A-Allel erhöht

Da die Latenz der Brusttumorentstehung immer noch groß war und um zwischen frühem und spätem p53-LOH zu unterscheiden, haben wir die Rate der p53-Inaktivierung in den Milchdrüsen in der Mitte der Laktation von primiparen Wildtyp-, p53-, T380A- und p53-T380A-Mäusen durch indirektes Auslesen von Cyclin . bestimmt B1 Deregulierung. Dieser Ansatz wurde gewählt, da die direkte Bestimmung von p53 LOH durch vor Ort Hybridisierung für p53-mRNA oder Immunhistochemie waren aus mehreren Gründen problematisch. Erstens ist die direkte Messung von p53 durch Immunhistochemie technisch anspruchsvoll, da die Expressionsniveaus normalerweise extrem niedrig sind. Zweitens, Bestimmung von TRP53 Locus LOH würde einen statistischen Ansatz erfordern, bei dem ein Ereignis, von dem erwartet wird, dass es extrem selten ist, durch einen Hintergrund falsch-negativer Zellen maskiert wird. Darüber hinaus wäre es schwierig, auf eine relativ kleine DNA-Region, die in der Mutante deletiert ist (ungefähr 350 bp), innerhalb des Hintergrunds des Signalrauschens von der Mutantenkopie abzuzielen. Schließlich direkte Messung von mRNA vor Ort würde den Nachweis eines 106 bp-Fragments von Exon 5 erfordern, das im mutierten Stamm deletiert ist, würde aber auch durch die Existenz eines prozessierten Pseudogens verwechselt werden. Sowohl Immunhistochemie als auch vor Ort Hybridisierung von p53-mRNA wurden ohne Erfolg versucht.

Bei menschlichen Tumoren wurde festgestellt, dass die Deregulierung von Cyclin B1 zumindest akut mit einem negativen p53-Status korreliert (Innocente et al., 1999 Cui und Donehower, 2000 Krause et al., 2000 Park et al., 2000 Yin et al ., 2001 Yu et al., 2002). In diesen Tumoren ist Cyclin B1 sowohl in Bezug auf den Zellzyklus dereguliert als auch massiv überexprimiert, sogar bis zu dem Punkt, an dem fehlgefaltetes Protein prozessiert und an der Zelloberfläche präsentiert wird, um eine Immunantwort hervorzurufen (Covini et al., 1997 Yu et al. , 2002). Dementsprechend stellt die Zugabe von funktionellem p53 die richtige Cyclin B1-Regulation wieder her (Yu et al., 2002). Wir führten das komplementäre Experiment durch, um die p53-Funktion in embryonalen Fibroblasten der Wildtyp-Maus durch retrovirale Expression von humanem Papillomavirus E6 teilweise zu entfernen ( 7c ). After 3-days growth with repeated daily infection, western analysis demonstrated increased levels of cyclin B1 in the E6-infected cells when compared to those infected with the empty vector. Cyclin A levels were comparable between the cultures indicating that this was not due to significant perturbation of the cell cycle. Furthermore, immunofluorescence microscopy demonstrated that this was the case throughout the cell cycle (Figure 7d). Thus even with only partial knockdown of p53 function typical of HPV E6 expression, there is a significant deregulation of cyclin B1 expression. Analysis of midlactation mammary glands by cyclin B1 immunohistochemistry revealed occasional intensely staining cells individually or in clusters (Figure 7a). This staining is distinct from cyclin B1 immunopositivity associated with cell proliferation, as similar analysis of rapidly proliferating tissues by the same technique revealed much lower staining intensities (data not shown). Staining in the tumors of the present study showed little or no expression except in occasional isolated foci of cells with low staining intensities in comparison to the midlactation studies. We interpret this as a transient and acute phenomenon that may be selected against with further tumor growth as cyclin B1 may act as a tumor antigen (Yu et al., 2002).

Indirect assessment of p53 loss by cyclin B1 immunohistochemistry. (ein) Cyclin B1 immunohistochemistry in 2-week post-partum midlactation mammary glands showing isolated (arrows) strong staining in glands from T380A and multicellular clusters staining positive in p53 +/− T380A mice. (B) The number of cyclin B1-positive cells was increased in the glands of p53 +/− T380A mice. Data represent the normalized means of 2–4 mice from each genotype five sections per primiparous mouse corresponding to the five glands from the right side of each animal. (C und D) Increased cyclin B1 expression in mouse embryonic fibroblasts with E6 at all stages of the cell cycle correlating B1 overexpression with p53 inactivation (C) by Western blot (WB), and immunofluorescence (IF), and (D) quantitation of IF cyclin B1 staining intensity. * P<0.001 by ANOVA.

Assessing p53 loss of function by cyclin B1 immunopositivity in midlactation mammary glands provided a number of important mechanistic insights. First, the frequencies of cyclin B1 immunopositive (presumably p53 null) cells associated with the different genotypes mirrored to a striking extent the relative frequencies of mammary tumorigenesis (compare Figure 7b to 2b). The frequency of strongly cyclin B1 immunopositive cells in the p53 +/− T380A mammary glands vastly exceeded combined frequency associated with the p53 +/− and T380A glands. These data suggest, therefore, that the number of p53 null cells generated underlies the probability of developing a mammary tumor. These data are consistent with deregulation of cyclin E driving LOH. Of course, a caveat inherent in these interpretations is that the assumption that cyclin B1 immunoreactivity is always equivalent to p53 nullizygosity cannot be proven. However, the remarkable parallel between cyclin B1 immunoreactivity and mammary tumor frequency strongly supports the validity of this assumption.


Ergebnisse

A population of freshly isolated mouse mammary gland cells forms mammospheres. Based on the established culture condition for human mammospheres ( 10), we tested various conditions for growing mouse mammospheres and opted to use the optimized medium containing 20 ng/mL EGF and 20 ng/mL bFGF. After 7 days of culture in this medium in a low-attachment culture plate, about 6 mammospheres with diameters >40 μm were formed per 10,000 freshly isolated mammary epithelial cells ( Fig. 1 Table 1, Experiment 1). The mammospheres contained an average of ∼250 cells, and similar numbers of sphere-forming cells were observed using cells isolated from C57BL/6J and FVB mice.

We attempted to use immunostaining and FACS to identify the fraction of mouse mammary gland cells that could form mammospheres. The tested antigens for immunostaining included CD24, a marker whose absence or expression at low levels characterizes human tumorigenic breast cancer cells ( 4) PrP and endoglin, both surface markers for mouse HSCs ( 12, 13, 17) and CD49f, a marker for in vivo repopulating mammary gland epithelial stem cells ( 7). The surface expression of these antigens in freshly isolated cells was analyzed by flow cytometry ( Fig. 1).

A representative FACS plot showed that 39.9% of total cells were negative for CD24 staining (CD24 − Fig. 1, CD24). Cells staining positively for CD24 (CD24 + ) could be further fractionated into CD24 med (4.2% of total cells) and CD24 high (54.0% of total cells) based on the relative levels of CD24 surface expression. The whole-cell population could also be fractionated into PrP − (92.5% of total cells), PrP med (5.1% of total cells), and PrP high (1.8% of total cells) based on PrP staining ( Fig. 1, PrP). Use of endoglin as a marker allowed fractionation into endoglin − (93.4%) and endoglin + (5.1%) subpopulations ( Fig. 1, Endoglin) similarly, scoring for the CD49f marker allowed fractionation into CD49f − (94.8%) and CD49f + (4.7%) subpopulations ( Fig. 1, CD49f). We also obtained the profiles of cells stained for CD24, PrP, endoglin, and CD49f in combination. We found that 4.2% of total mammary epithelial cells were CD24 + CD49f + , of which 8.4% and 20.7% were PrP + endoglin + and PrP + endoglin − , respectively ( Fig. 1, CD24 PrP Endoglin CD49f).

To identify the subpopulations of cells in the mouse mammary glands that were capable of forming mammospheres, we first plated freshly isolated CD24 − , CD24 med , and CD24 high cells in sphere-forming conditions. Only CD24 + cells, including both CD24 med and CD24 high cells, grew into typical mammospheres ( Fig. 1, rechts Table 1). The majority of sphere-forming ability resided in the CD24 high cells. In one of our experiments ( Table 1, Experiment 1), 10,000 CD24 high or CD24 med cells generated an average of 9.2 or 1.2 spheres, respectively, whereas the same numbers of CD24 − cells formed no spheres. Hence, freshly isolated mammosphere-initiating cells expressed CD24 at readily detectable levels.

We also tested the mammosphere-forming abilities of cells fractionated based on their cell surface expression of either PrP or endoglin. Whereas cells with no or high PrP staining formed none or few spheres, respectively ( Table 1), PrP med cells were capable of generating far more spheres, yielding ∼8.5 mammospheres per 10,000 cells in a representative experiment ( Fig. 1 Table 1, Experiment 1). Sphere-forming cells also resided in the endoglin + fraction (8.2 ± 1.6 spheres/10,000 cells) but very few in the endoglin − fraction (0 sphere/10,000 cells Fig. 1 Table 1, Experiment 1) as well as in the CD49f + fraction (4.2 ± 1.5 spheres/10,000 cells Table 1, Experiment 1) conversely, almost no mammosphere-forming cells were present in the CD49f − population (0.7 ± 0.2 sphere/10,000 cells Fig. 1 Table 1, Experiment 1). We repeated the mammosphere-forming experiment and observed the same trend ( Table 1, Experiment 2).

When we fractionated cells based on their cell surface expression of the CD24, PrP, endoglin, and CD49f markers, 10,000 CD24 + PrP + endoglin + CD49f + cells were capable of forming an average of 19.2 spheres ( Table 1, Experiment 1). This sphere-initiating activity is higher than that of CD24 high , PrP med , or endoglin + cells. We noticed that the CD24 + endoglin + CD49f + fraction contains largely PrP med cells ( Fig. 1). Overall, this indicated that CD24 + PrP med endoglin + CD49f + mouse mammary epithelial cells are enriched for mammosphere-initiating cells.

Cultured mammary gland cells have altered surface phenotype of mammosphere-initiating cells. We next tested whether in vitro culture of the mouse mammary gland cells could affect their display of critical cell surface markers as well as sphere-forming activity. To this end, mouse mammary glands were isolated and organoids were cultured for 6 days before immunostaining. The surface expression of CD24, PrP, endoglin, CD49f, and CD44 in cells from cultured organoids was then analyzed, as before, by flow cytometry ( Fig. 2EIN).

A representative FACS plot of such precultured mammary gland cells revealed that 12% of total cells were CD24 − ( Fig. 2A, plot 1). In either the CD24 − or the CD24 + fraction, about two thirds of the cells were PrP + (plot 1). PrP + and PrP − cells could be further fractionated by endoglin staining (plot 2). In addition, we also examined the surface coexpression of CD44 or CD49f with CD24, PrP, and endoglin. Two thirds of CD44 + cells were CD24 − (plot 3). Half of CD49f + cells were also endoglin + (plot 4). Hence, such in vitro culture resulted in an increase in those cells expressing certain markers, such as CD24, PrP, endoglin, and CD49f.

We undertook to investigate the effects of this in vitro culture on the subsequent ability of the mammary cells to generate spheres in vitro. In these experiments, we chose to focus on CD24, PrP, and endoglin as cell surface markers. Using the same sphere-forming conditions as in Fig. 1 and Table 1, we observed that precultured cells formed numbers of mammospheres comparable with those arising from freshly isolated cells. Thus, whereas 10,000 freshly isolated mammary epithelial cells yielded an average of 6.1 spheres, an average of 4.1 mammospheres were generated from 10,000 precultured mammary gland cells ( Fig. 2B, left). This indicated that propagation of mouse mammary epithelial cells in monolayer cultures did not yield a significant change in the proportion of sphere-forming cells. The mammospheres formed by precultured cells had an average diameter of 100 μm ( Fig. 2B, left).

We then examined which subpopulations of precultured cells could form mammospheres. When we plated precultured CD24 + and CD24 − cells in sphere-forming conditions, to our surprise, only CD24 − cells grew into mammospheres ( Fig. 2B, right). CD24 − cells (10,000) generated an average of 16.7 spheres with a diameter of 162 μm. In contrast, CD24 + cells formed only small irregular aggregates composed of several cells ( Fig. 2B, middle). Hence, after preculturing (6 days of in vitro growth of organoids before mammosphere culture), mammosphere-initiating cells resided exclusively in the CD24 − fraction. This was in contrast to the behavior of freshly isolated mammary epithelial cells, in which the sphere-initiating activity resided in the CD24 + fraction.

We further subfractionated the CD24 − fraction of precultured cells into PrP + and PrP − populations and tested the sphere-initiating capability of each of these subpopulations. Whereas CD24 − PrP − cells were capable of growing into larger spheres, CD24 − PrP + cells produced smaller spheres. In a representative experiment ( Fig. 2C), 400 precultured CD24 − PrP − cells generated 1 sphere with an average diameter of 201 μm, whereas the same number of precultured CD24 − PrP + cells generated spheres with an average diameter of 146 μm. When we plated 200, 100, or 50 cells from these CD24 − PrP + and CD24 − PrP − fractions, they all generated a single sphere. In addition, in all cases, CD24 − PrP − cells formed larger spheres ( Fig. 2C). Therefore, in contrast to freshly isolated cells, in which the sphere-initiating cells are enriched in the PrP med fraction, precultured cells contain PrP − cells as their major sphere-initiating population.

When we fractionated precultured cells based on their cell surface expression of CD24, PrP, and endoglin, the CD24 − PrP − endoglin + cells formed the greatest numbers of mammospheres these were also the largest in size. Table 2 summarizes the results of mammosphere formation by these various cell populations in a representative experiment. For example, 2,000 of CD24 − PrP − endoglin + cells generated an average of 1 sphere with an average diameter of 138 μm. The same number of CD24 − PrP − endoglin − cells produced 1 sphere with a diameter of 70 μm. As expected, CD24 − PrP + endoglin + and CD24 − PrP + endoglin − cells produced smaller spheres at lower frequencies than CD24 − PrP − endoglin + cells. Therefore, the CD24 − PrP − endoglin + fraction of the precultured cells is enriched for sphere-initiating cells.

In summary, the surface phenotype of mammosphere-initiating cells changes dramatically following in vitro Kultur. For freshly isolated cells, CD24 + PrP med endoglin + cells are enriched for sphere-initiating cells following culture, sphere-initiating cells are enriched in the CD24 − PrP − endoglin + population.

Table 2 also shows that, as we progressively reduced the number of cells introduced into the sphere culture, we observed fewer and smaller spheres. Nevertheless, a sphere could be generated by as few as five plated precultured CD24 − PrP − cells ( Table 2), indicating that this cell population is highly enriched for sphere-forming cells. We were therefore intrigued to know whether a mammosphere can be formed from a single initiating cell introduced into the sphere culture.

Two approaches were adopted to address this possibility. In the first, mammary gland cells isolated from GFP + and control non–GFP-expressing mice were mixed in a ratio of 1:10 and plated for sphere formation. If the sphere is initiated from a single cell, then ∼10% of finally formed spheres should be formed exclusively by GFP + cells. However, as the result showed, 9% of spheres were composed largely of GFP + cells, and 10% of these were formed exclusively from GFP + cells ( Fig. 3EIN), whereas the remainder was a mix of GFP + and GFP − cells. Therefore, only 0.9% of spheres contained exclusive GFP + cells. This suggests that the majority of spheres were formed by more than a single initiating cell.

In the second approach, we isolated cells from the primary mammospheres and plated individual cells into each well of a 96-well plate by serial dilution. We observed that 5% of the wells inoculated with single cells formed sphere-like structures ( Fig. 3B). However, these sphere-like structures were generally smaller in size compared with the mammospheres that we typically observed. Because of the positive correlation of the size of the sphere structure and the introduced cell number ( Table 2 data not shown), we propose that single cells generally tend to form smaller spheres or sphere-like structures and that accessory cells may help to form the larger mammospheres that we typically observed. Alternatively, smaller sphere-like structures may adhere to one another and grow into larger mammospheres.

Mammospheres contain mammary gland–repopulating cells. We sought to determine whether the cells present in mammospheres could repopulate the entire mammary gland following engraftment into cleared mammary fat pads. To this end, we isolated mammospheres formed by precultured GFP + CD24 − PrP − cells and also collected all the precultured GFP + CD24 − PrP + cells, which only formed the amorphous nonsphere cell aggregates. We then trypsinized these various cells and transplanted 2,000 of each of these dissociated cell populations into cleared fat pads of recipients. Whereas 2,000 cells from mammospheres derived from the CD24 − PrP − fraction generated entire mammary ductal trees, 2,000 of the cultured CD24 − PrP + cells failed to do so ( Fig. 4EIN). This suggests that some mammospheres contain stem cells that have the in vivo repopulating activity.

In other studies, Mani et al. (ref. 18 and footnote 5 ) suggested that there is a link between the property of MGSCs and epithelial-mesenchymal transition (EMT). It was shown that freshly isolated MGSCs reduced expression of E-cadherin and increased expression of N-cadherin and Smad-interacting protein 1 (SIP1 ref. 18 and footnote 5 ). We therefore examined the expression of relevant genes in cultured sphere-forming cells. As Fig. 4B shows, when compared with freshly isolated nonstem cells, cultured sphere-forming cells had increased expression of EMT markers N-cadherin, vimentin, and SIP1 but decreased levels of epithelial-specific transcription factors, such as E-cadherin, cytokeratin 14, and cytokeratin 18. This further suggests that cultured sphere-forming cells shared the similar molecular machinery as freshly isolated stem cells.

Cytogenetic analysis of mammosphere-forming cells. To get insight into karyotype constitution of mouse mammary cells after culture, we sought to conduct spectral karyotyping of freshly and precultured mammosphere-forming cells. Due to the very small numbers and very slow proliferation of these cells, it was practically impossible to undertake cytogenetic analysis immediately after the FACS. Accordingly, we expanded both FACS-fractionated freshly isolated and precultured mammosphere-forming cells by additionally culturing them until we could obtain minimal numbers of mitotic cells for harvest and analysis. After ∼3 weeks in culture, we were able to obtain a few metaphase spreads from both cell types. All available metaphases were counted for chromosome number, whereas a limited number of metaphases with less contracted chromosomes were hybridized for SKY analysis. Under those experimental conditions, both originally freshly isolated and precultured cells exhibited aneuploidy (Supplementary Fig. S1) with chromosome numbers ranging from hypodiploid (35) to hypertetraploid (88). Yet, both samples contained a distinct fraction of true diploid and tetraploid cells.

The SKY analysis provided an insight, albeit limited in size and scope, into structural karyotypic features of freshly isolated and precultured mouse mammary cells. None of the karyotypes from freshly isolated cells (Supplementary Fig. S2EIN und B), regardless of their ploidy status, contained structurally rearranged chromosomes, such as derivatives resulting from deletions or translocations. Precultured cells, on the other side, in addition to diploid or near-diploid karyotypes without structural rearrangements (Supplementary Fig. S2C), exhibited sporadic, nonrecurrent structural chromosomal rearrangements (Supplementary Fig. S2D und E), such as translocations t(619), t(612), and t(78).


Diskussion

In the present study, we analyzed development of mammary tumors in a conditional mouse model with the p53.R270H missense mutation, equivalent to human R273H, targeted into the genome of the mouse. Importantly, the wild-type and mutant p53 proteins are expressed at physiologic levels ( 19). heterozygot p53 R270H/+ mice developed a high frequency of spontaneous mammary tumors after tissue-specific expression of the p53.R270H mutation using WAPCre Mäuse. The mean latency time for tumor development in p53 R270H/+ WAPCre mice was strongly reduced when compared with previous studies with tissue-specific transplantation models ( 16), even though the BALB/c mouse strain used in the earlier studies is much more sensitive for mammary tumor development than C57BL/6 / 129 mice ( 11, 36), the genetic background of mice used here.

We here show that heterozygous loss of p53 in p53 F2−10/+ WAPCre mice does not predispose for spontaneous mammary tumors up to 48 weeks after Cre expression, whereas, at this time point, 64% of p53 R270H/+ WAPCre mice had developed one or more mammary gland tumors ( Fig. 3EIN). These observations clearly show that the p53.R270H mutation may have dominant-negative properties. In addition, comparison of mammary tumor development in p53 R270H/+ WAPCre mice with p53 R270H/F2−10 und p53 F2−10/F2−10 mice 5 reveals that latency times are not significantly different between the three genotypes (P = 0.86). These results point towards a lack of gain of function mechanisms of the p53.R270H mutant in the mammary gland. Interestingly, because in a previous study Olive et al. ( 19) did show gain of function properties of this p53 mutant allele mainly in the lung using the same mouse model, gain of function properties of p53 apparently are tissue specific. In summary, mammary tumor development in p53 R270H/+ WAPCre mice is evidently not simply caused by functional inactivation of one p53 allele, but rather shows functional inactivation of both alleles through dominant-negative action of mutant p53, as also described previously for these mice ( 19). Further indication for this was provided by LOH analysis of spontaneous p53 R270H/+ WAPCre tumors. Although we observed the majority of mammary tumors (partly) losing the wild-type p53 allele, the wild-type fragment could still be detected, indicating that a proportion of tumor cells retained the wild-type p53 Allel. We therefore hypothesize that the p53.R270H mutation has a dominant-negative effect in early stages of mammary tumorigenesis, resulting in overall genome instability, followed by LOH later in tumor development. However, to address this, further studies are needed in analyzing LOH in preneoplastic stages of mammary gland development in p53 R270H/+ WAPCre Mäuse.

Tumor types found were adenocarcinomas and (carcino)sarcomas, the former also frequently found in human breast cancer patients, the latter uncommon in mammary glands of mice and man. In general, sarcomas are often found in p53 +/− mice ( 8) and Li-Fraumeni syndrome patients ( 9), but no sarcomas of the mammary gland were reported thus far. However, (carcino)sarcomas of the mammary gland were found recently in conditional p53 F2−10/F2−10 K14Cre mice, with homozygous p53 deletion of exons 2 to 10 in epithelia, 6 pointing towards a role for defective p53 in mammary sarcoma development.

Apart from mammary gland tumors, some untreated p53.R270H mutant mice developed additional tumors. Expression of the p53.R270H mutation seemed to be not exclusively restricted to the mammary gland, but was also visible in some tumors and kidneys of older mice. This is most likely caused by some Cre expression in other tissues than the mammary gland, as was also described by others ( 18, 27). Another possibility is minor leakiness of the stop cassette, resulting in low levels of transcription of the mutant p53 allele in some tissues when mice age.

Steroid status is one of the main differentiating characteristics of human breast cancer. About 70% of human breast tumors are estrogen receptor α positive and estrogen receptor dependent however, mouse models rarely produce estrogen receptor α–positive mammary tumors ( 32). Therefore, it would be highly valuable to have mouse models developing estrogen receptor α–positive as well as estrogen receptor α–negative mammary tumors to study the factors that control estrogen receptor α expression and the effect of therapeutics. In the present study, mammary tumors of both estrogen receptor types were found in p53 R270H/+ WAPCre mice, with the pattern of estrogen receptor α expression (groups of contiguous cells) similar to that found in human breast carcinomas ( 37). These results resemble those reported recently ( 18), where homozygous conditional deletion of mouse p53 in mammary epithelial cells by WAPCre also led to estrogen receptor α–positive mammary tumors in mice. Apparently, inactivation of p53 induced by WAPCre expression, either through complete loss of both alleles or expression of mutant variants, directs estrogen receptor α–positive tumor development.

It is generally agreed that environmental factors and somatic genetic events are the predominant contributors to the development of sporadic cancer. Whether exposure to environmental compounds also has a significant effect on cancer development in the presence of an inherited, dominant mutant p53 allele was examined by exposing p53 R270H/+ WAPCre mice to the mammary carcinogen DMBA. Others have shown cooperation of DMBA with p53 mutation or p53 deficiency in several studies ( 11, 16). Here, latency time of DMBA-induced mammary tumors in p53 R270H/+ WAPCre mice was shortened compared with untreated mice when mice were treated at a very young age (28-70 days), a period encompassing mammary gland development and terminal end bud proliferation and maturation. Interestingly, the latency time for mammary tumor development in older (98-140 days) DMBA-treated p53 R270H/+ WAPCre mice is similar to untreated p53 R270H/+ WAPCre mice (data not shown), indicating that age at the time of exposure is a significant factor in mammary tumor development. No histologic differences were observed between spontaneous and DMBA-induced mammary tumors, with estrogen receptor α–positive and –negative tumors found in all groups. A small difference was found in the grade of estrogen receptor α positivity: DMBA-induced tumors stained slightly more positive (data not shown).

Expression profiles of specific genes seemed to change during mammary tumor development in both DMBA-treated as well as untreated mice. Interestingly, the breast tumor–related oncogene cyclin D1 is specifically induced in DMBA-treated tumors, in line with previous results obtained with DMBA-treated rats ( 38, 39). In contrast, other cyclins are down-regulated, which was unexpected because expression levels of these genes are frequently induced in mouse mammary tumors ( 40). The clearest example for this is cyclin G. Presumably, this reflects the p53 dependence of this gene because we showed before that p53.R270H embryonic stem cells display diminished activation of cyclin G after γ-irradiation compared with wild-type cells ( 26). As a result, in mammary gland tumors solely consisting of p53 mutant cells, levels of cyclin G will be much lower compared with noncancerous mammary glands also containing cells that do not express the R270H mutant protein. Indeed, comparing expression profiles of p53-mutant mammary glands with those of wild-type littermates reveals cyclin G and other genes differentially expressed, underscoring the p53 dependency of these genes and the disturbance of RNA expression levels in R270H mutant mammary glands.

Differences exist in gene expression profiles in tumors obtained from untreated and DMBA-treated p53 R270H/+ WAPCre mice, limited to a few selected genes like GADD45, cyclin D1 und cyclin D3, Ki67, und Noxa. Die Ebenen von GADD45, a well-known DNA damage and p53 responsive gene, were slightly induced in untreated tumors, whereas in DMBA-induced tumors levels were decreased. This difference may well be explained by the role GADD45 is playing in nucleotide excision repair, a repair system recognizing DMBA-induced adducts ( 41). Ebenen von GADD45 in normal mammary glands might be higher in DMBA-treated than in untreated mice to facilitate DNA repair in response to the introduction of DNA damage. Indeed, expression levels of GADD45 are twice higher in mammary glands of DMBA-treated mice compared with those of untreated p53 R270H/+ WAPCre mice (data not shown), explaining the relative difference of GADD45 levels in tumors. Another explanation could be the selective proliferation of cells with low repair capacity into preneoplastic lesions. Clearly, these primary expression analyses reveal unique signatures for p53 mutant and carcinogen-induced mammary tumors. In addition, we found some human relevant breast cancer genes up-regulated in mammary tumors of p53 R270H/+ WAPCre mice (i.e., cyclin D1, a breast tumor related oncogene found up-regulated in 35% of human breast cancers, and Ki67, frequently coexpressed with estrogen receptor α in estrogen receptor α–positive human tumors). These results, although the number of genes analyzed is low, are interesting, in that they show that molecular events underlying mammary gland tumor development in the p53 R270H/+ WAPCre mouse model may be, at least to some extent, similar to those occurring in human breast cancer development. However, to identify the cooperating oncogenic events in the development of mammary tumors in p53 R270H/+ WAPCre mice, a genome-wide analysis of both spontaneous and DMBA-induced tumors needs to be done.

In conclusion, conditional knock-in mouse models (as the p53.R270H mutant), with mutations equivalent to those found in humans targeted into the mouse genome, show tumor responses and tumor types highly comparable to human cancer. As such, these models are very suitable to establish precise genotype-phenotype relationships between p53 hotspot mutations found in humans and tumorigenesis in specific tissues like the breast. Ultimately, these highly human relevant mouse models can be used to study the effectiveness of novel cancer therapies.


Abstrakt

Insulin-like growth factor I (IGF-I) is known to regulate mammary gland development. This regulation occurs through effects on both cell cycle progression and apoptosis. Our laboratory has studied the IGF-I-dependent regulation of these processes by using transgenic and knockout mouse models that exhibit alterations in the IGF-I axis. Our studies of transgenic mice that overexpress IGF-I during pregnancy and lactation have demonstrated that this growth factor slows the apoptotic loss of mammary epithelial cells during the declining phase of lactation but has minimal effects during early lactation on milk composition or lactational capacity. In contrast, our analysis of early developmental processes in mammary tissue from mice carrying a targeted mutation in the IGF-I receptor gene suggests that IGF-dependent stimulation of cell cycle progression is more important to early mammary gland development than potential anti-apoptotic effects. With both models, the effects of perturbing the IGF-I axis are dependent on the physiological state of the animal. The diminished ductal development that occurs in response to loss of the IGF-I receptor is dramatically restored during pregnancy, whereas the ability of overexpressed IGF-I to protect mammary cells from apoptosis does not occur if the mammary gland is induced to undergo forced involution. Data from our laboratory on the expression of IGF-signaling molecules in the mammary gland suggest that this effect of physiological context may be related to the expression of members of the insulin receptor substrate family.


Download gratis en vrijblijvend de informatiebrochure

Top 10 meest aangevraagd

Ontdek 90.454 producten om je volledige potentieel mee te bereiken. Bekijk de top 10 gerelateerd aan Biologie:

Lactation Biology

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Coursera (CC)

Proefdierkunde Hbo Biotechnicus

  • BTW: Vrij van BTW
  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
  • Extra informatie:Het minimum aantal deelnemers is drie. Meer informatie lees je bij Overige informatie – Kosten.
Hogeschool Utrecht

Leraar Biologie tweedegraads

  • BTW: Vrij van BTW
  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
  • Extra informatie:Bereken welk tarief voor jou geldt Bekijk de financieringsmogelijkheden van de Lerarenbeurs
Hogeschool Utrecht

Master Leraar Biologie

  • BTW: Vrij van BTW
  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
  • Extra informatie:Dit is het minimale collegegeldtarief per jaar. Bereken welk tarief voor jou geldt Bekijk de financieringsmogelijkheden van de Lerarenbeurs
Hogeschool Utrecht

Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek (Life Sciences)

  • BTW: Vrij van BTW
  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
  • Extra informatie:Dit is het minimale collegegeldtarief per jaar. Bereken welk tarief voor jou geldt. Bekijk de mogelijkheden voor een tegemoetkoming in de studiekosten.
Hogeschool Utrecht

Biology: Animal development: We're just tubes

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Khan Akademie

Biology: Natural Selection

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Khan Akademie

Biology: Ape clarification

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Khan Akademie

Biology: Speciation: Of ligers & men

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Khan Akademie

Biology: Variation in a species

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Khan Akademie

Verder leren? Het begint op Springest.nl

  • Meer dan 90.000 cursussen, opleidingen, trainers, coaches, e-learning en incompany trainingen.
  • Ruim 115.000 onafhankelijke ervaringen helpen je kiezen voor de beste opleiders.
  • Hulp bij het zoeken en inschrijven
  • Gratis informatie aanvragen
  • Klaar om te gaan leren? Schrijf je direct in, gratis annuleren is mogelijk!
  • Ook voor leren in je organisatie.

Kies de richting van je persoonlijke ontwikkeling

Over Springest

Springest is dé site waar je alles vindt voor je persoonlijke ontwikkeling. Zoek, vergelijk en kies uit 88.000 producten, zoals trainingen, cursussen, opleidingen, webinars, coaches, e-books, incompany trainingen, evenementen en behandelingen van meer dan 8.100 verschillende aanbieders. Bekijk ook onze NL Leert Door pagina, Springest helpt Nederland ook in de coronacrisis met leren.

Ons rapportcijfer Onze bezoekers geven ons een Stern8,8 in 711 reviews op The Feedback Company. Leren & corona: klassikaal met 1,5m maatregelen. Thuis met:computer 15.000 e-learnings

Diskussion

Although several reports have suggested that increased Lcn2 expression in breast cancer may be detrimental (8, 11, 26), the precise in vivo role of Lcn2 in breast cancer initiation and progression has been challenging to define. In this study, we have shown that Lcn2 is important for PyMT-induced mammary tumor initiation and growth. Previous studies employed xenograft models to elucidate the role of Lcn2 in breast cancer, a methodology that cannot emulate the multistage nature of human breast cancer progression. We have used the well-characterized MMTV-PyMT mouse model (12) to show that genetic ablation of Lcn2 leads to a significant reduction in palpable mammary tumors in both the 129/Ola and C57/B6 backgrounds. Interestingly, the development of multifocal dysplastic lesions, the earliest event in PyMT-induced mammary cancer initiation, was not affected by a lack of Lcn2. These results point to the involvement of Lcn2 only in the later stages of primary mammary tumor progression.

The most striking result arising from our study was the dramatic drop in mammary tumor burden in virgin female Lcn2-deficient mice at ∼20 weeks of age. Although almost all Lcn2 +/+ PyMT mice had reached the maximum permitted tumor burden by this age, no Lcn2 −/− PyMT mouse had accumulated sufficient tumors to warrant sacrifice. These data point to a role for Lcn2 in primary tumor development that is consistent with published reports, and confirm Lcn2 as an important oncogenic factor in PyMT-induced mammary tumorigenesis.

Lcn2 reportedly forms a complex with MMP-9 that prevents autodegradation of this enzyme and thus sustains its activity. MMP-9 promotes cancer progression by perforating cellular basement membranes, degrading the ECM, and liberating vascular endothelial growth factor. Angiogenesis, invasion, and metastasis are thus all indirectly enabled by Lcn2. In our study, we detected a statistically significant but slight reduction in MMP-9 activity in the plasma of tumor-bearing Lcn2 −/− PyMT B6 mice compared with Lcn2 +/+ PyMT B6 mice. However, this reduction represents only a small decrease in total MMP-9 activity and likely does not explain the markedly decreased tumor burden in Lcn2-deficient mice. Indeed, Martin et al. showed that MMP-9 −/− MMTV-PyMT mice do not show any difference in primary mammary tumor burden compared to MMP-9 +/+ MMTV-PyMT controls (20), indicating that MMP-9 is not critical for PyMT-induced mammary tumor formation. Consequently, Lcn2’s oncogenic role is at best only partly dependent on its ability to stabilize MMP-9. Intriguingly, MMP-9 −/− MMTV-PyMT mice do show a decrease in mammary tumor-derived lung metastases but only in mice of the C57BL/6 background (20). In our study, we were unable to detect a statistical difference in metastasis formation in the absence of Lcn2, regardless of genetic background. These findings reinforce the notion that Lcn2 acts as an oncogene independently of MMP-9.

Several groups have advanced other hypotheses as to how Lcn2 might exert its oncogenic function. These theories include induction of the epithelial-to-mesenchymal transition (11) and inhibition of the PI3K/Akt pathway (19). We are currently investigating these potential mechanisms in our Lcn2 −/− PyMT mice.

In conclusion, our in vivo analyses of genetically modified tumor-prone mice have identified Lcn2 as an oncogene important for the later stages of primary mammary tumor development but not for the formation of lung metastases. The precise mechanism underlying this oncogenic function of Lcn2 appears to differ from its bacteriostatic function but remains to be fully elucidated. Future studies may pinpoint Lcn2 as a candidate therapeutic target for human breast cancer.


Elektronisches Zusatzmaterial

Differentially expressed between time points 1 h and 24 h in un-inoculated control cells

Zusätzliche Datei 1: . Lists of differentially expressed genes between time points 1 h and 24 h of un-inoculated control cells. Gene symbol, log2 fold changes as well as Entrez gene names are provided for each of the two paternally inherited SCS-BTA18-QTL alleles. Genes were selected on the basis of FDR adjusted p-values of q ≤ 0.05. (XLS 55 KB)

List of genes showing a significant co-expression in time-course after inoculation with heat inactivated

Additional file 2: E coli und S. aureus in SCS-BTA18-Q and SCS-BTA18-q cells, respectively. Significantly co-expressed genes in S. aureus und E coli inoculated SCS-BTA18-Q and SCS-BTA18-q cells identified using the clustering algorithm implemented in the short time-series expression miner STEM [28, 29] (version 1.3.6). Only genes with a fold change of log2 fc ≥ 0.75 in time-course were considered. Significance was assessed based on the non-random co-expression of genes by comparing the number of genes assigned to a specific co-expression profile model to the expected number of genes assigned to the co-expression profile model quantified by permutation. The number of the profile, the human gene symbol and the log fold changes for time points 0 h, 1 h, 6 h and 24 h are shown. (XLS 134 KB)


Schau das Video: Gramser på bikinipiger SELVGLAD 1:10 med Katrine Gisiger (Januar 2022).