Information

Sollte die Länge der Elektroden in der Elektrophoresekammer proportional zur Kammergröße sein?


Ich versuche, eine kleine horizontale Elektrophoresekammer von Grund auf neu zu bauen. Ich möchte es für Comet-Assays verwenden und werde nur 1 Objektträger verwenden, also wird er ungefähr 3 cm breit, 10 cm lang und 4 cm hoch sein, gerade genug, um den Objektträger und eine kleine Menge Puffer zu passen. Soweit ich weiß, ist so etwas nicht im Handel erhältlich, also bevor ich es mache, möchte ich sicherstellen, dass es funktioniert. Das Hauptproblem sind die Kosten der Elektrode (muss Platindraht sein). Ich möchte nicht so viel Geld ausgeben, nur um zu erkennen, dass es nicht funktioniert. Meine Frage ist: ist eine 3cm Elektrode in einem 60-70cm3 genug? Gibt es grundsätzlich physikalische Einschränkungen hinsichtlich der Größe und Position der Elektroden und der Form der Kammer? Da ich Biologe bin und meine Kenntnisse in Physik recht begrenzt sind, würde ich mich über diesbezügliche Informationen sehr freuen.


Diese Anweisungen zum Bau einer Elektrophoresekammer kommentieren nicht die Mindestlänge des Drahtes, schlagen aber andererseits vor, einen sogenannten Monel-Seizing-Draht (Ni/Cu-Legierung - £ 8,95 für 10 m in Großbritannien) oder 20-Gauge zu verwenden Kupferdraht, wenn Sie also deren Ratschläge befolgen, müssen Sie sich wahrscheinlich keine Gedanken über die Kosten machen.

Ich kann mir vorstellen, dass Legierungselektroden nicht so lange halten, aber sie wären billig zu ersetzen - tatsächlich würden Sie nach Möglichkeiten suchen, Ihren gesamten überschüssigen Draht aufzubrauchen!


Spurthi's AP Biologie Notizbuch


Abstrakt
Die Gelelektrophorese ist eine Methode, bei der Moleküle basierend auf der Bewegungsgeschwindigkeit durch das Gel während des Anlegens eines elektrischen Feldes getrennt werden. Die Richtung, in die sich die Moleküle bewegen (vorwärts oder rückwärts), hängt von der Ladung der Moleküle ab, da sie sich in Richtung ihres polaren Gegenteils bewegen. Wie schnell sich diese Moleküle bewegen, wird auch von den physikalischen Aspekten des Moleküls beeinflusst, wie Größe und Form, der Dichte des Gels und der Stärke des elektrischen Feldes. Da die Dichte des Gels und die Stärke des elektrischen Feldes für alle Moleküle in einer gegebenen Elektrophoresekammer gleich sind, haben die kleinsten Partikel die schnellste Bewegungsgeschwindigkeit.

Da wir für dieses Labor keine DNA verwenden konnten, mussten wir sie durch Farbstoffe ersetzen. Diese Beladungsfarbstoffe enthalten Saccharose, Bromphenolblau und TE-Puffer. Wir haben die Gelatine so gemacht, dass sie am anderen Ende kleine Schlitze hat. In diesen Dellen würden wir sie mit unterschiedlichem Farbladefarbstoff auffüllen. Der Beladungsfarbstoff sank auf den Boden, da er die Saccharose enthielt. Das Bromphenolblau war die Art und Weise, wie sie sich bewegen konnten, entweder positiv oder negativ. Basierend darauf, wohin sich der Farbstoff bewegt, können wir feststellen, wie groß die Moleküle darin waren und ob er positiv oder negativ war.

Teil 1
Zuerst gossen wir ein Gel mit einem Wasserbad, Mikrowelle, 6-Well-Gelkamm, Abdeckhahn, Tablett und Agarosegel. Mit dem Abdeckband bedeckten wir die beiden Enden der Gelgussschale, um das Herausfallen des Agarosegels zu verhindern. Als nächstes ließen wir das Gel im Wasserbad schmelzen, das es nicht lange genug erhitzte. Daher haben wir die Gelflasche mit abgenommenem Verschluss in 1-Minuten-Intervallen in der Mikrowelle erhitzt, bis sie vollständig geschmolzen war. Mit Schutzhandschuhen haben wir die Flasche herausgenommen, 15 ml der Flüssigkeit in ein Reagenzglas abgemessen und die 15 ml in die Gießschale verwendet. Bevor wir das Gel auf das Tablett gegossen haben, platzieren wir jedoch den 6-Well-Gelkamm in der Nähe des Endes des Tabletts. Nachdem das Gel auf der Schiene ausgehärtet ist, entfernen Sie den Abdeckhahn an einer Seite. Bevor Sie das Gel vorsichtig schieben, ohne in die Kammer einzubrechen, gießen Sie Puffer aus einem Becherglas in eine Seite der Kammer. Nachdem Sie das Gel auf die Kammer gelegt haben, fügen Sie Puffer hinzu, bis der Füllstand ungefähr 2-3 mm über der Oberseite des Gels liegt. Schließen Sie die Kammer und lassen Sie sie 24-48 Stunden in dieser Position bleiben.
Teil 2
2 Tage später das Gel aus der Kammer wieder auf die Platte übertragen, damit es perfekt passt. Als nächstes legen Sie die Platte mit dem Gel wieder in die Kammer und gießen den Puffer so in die Kammer, dass er sich etwa 2-3 Millimeter über dem Gel befindet. Nehmen Sie mit einer Mikropipette eine Farbe des Farbstoffs und erhalten Sie 10 ul davon. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 weitere Male mit verschiedenen Farbstofffarben und verwenden Sie verschiedene Mikropipetten für jede Farbe. Verbinden Sie als nächstes 5 Alkalibatterien in einem Stapel und verbinden Sie das rote Kabel und das schwarze Kabel der Batterien mit den entsprechenden Teilen der Kammer. Sobald der Akku mit der Kammer verbunden ist, beobachten Sie das Auftreten von Blasen und ob sich die verschiedenfarbigen Farbstoffe bewegen und wenn ja, in welche Richtung der Kammer. Trennen Sie nach der Beobachtung den Akku, wenn sich die sich am schnellsten bewegende Farbstoffprobe dem Ende des Gels nähert.


Dies wurde innerhalb von Minuten nach der Aktivierung des elektrischen Felds genommen. Wie Sie sehen können, haben die meisten Farbstoffe eine langsame Bewegungsrate.

Dieses Foto wurde aufgenommen, bevor die Drähte getrennt und der Stromfluss gestoppt wurde. Die durch dieses Foto bestätigten Ergebnisse sind unten aufgeführt.

Länge und Richtung des Laufs werden durch die Ladung des Moleküls bestimmt. Aus den Ergebnissen können wir dann schließen, dass der Kristallviolettfarbstoff am negativsten ist. Es ist auch das einzige negativ geladene Molekül in unserem Labor. Methylgrün war am positivsten, gefolgt von der Farbstoffmischung, Xylolcyanol und schließlich Bromphenolblau.

Der Kristallviolettfarbstoff war nicht in der Farbstoffmischung enthalten, da in Spur 6 keine Farbstoffbande gefunden wurde.

Bestimmte Farbstoffe wandern in Richtung der positiven Elektrode und andere in Richtung der negativen Elektrode, weil Moleküle in einem elektrischen Feld zu einer Ladung neigen, die der entgegengesetzten Ladung entspricht, die sie tragen. Daher tendieren positive Moleküle zum Negativen und umgekehrt.

Eine Erhöhung der Agarosekonzentration in einem Gel verringert die Porengröße des Gels, sobald das Gel erstarrt ist. Die kleinere Porengröße kann verwendet werden, um eine Mischung kleinerer Moleküle zu trennen.

Wenn die Trennung der Farbstoffe in einem Agarosegel mit einem höheren Prozentsatz stattfand als bei der Trennung vieler DNA-Mischungen. Wir können davon ausgehen, dass die Farbstoffmoleküle im Allgemeinen kleiner sind als die DNA-Fragmente.

Wenn wir aus unserem Elektrophorese-Labor gerufen würden und unser Labor nicht überwachen könnten, würden sich die Farbstoffproben im Laufe der Zeit entweder zur negativen oder zur positiven Seite der Pole bewegen. Wenn wir es lange genug wegließen, würde sich das Gel vom Gel lösen.

Das Agarose-Elektrophorese-Verfahren für DNA unterscheidet sich von unserem Verfahren, da DNA für das Auge nicht sichtbar ist, so dass ein Tracking-Farbstoff auf den DNA-Proben erforderlich ist, um zu sagen, wann das Elektrophorese-Labor beendet werden soll. Ein weiterer Unterschied besteht darin, dass DNA eine negative Ladung trägt, sodass die Proben an einem Ende des Gels statt am anderen platziert werden.

Elektrophorese vs. Chromatographie

Elektrophorese-Setup


Eine andere Verwendung für die Elektrophorese könnte Gentechnik, Proteinidentifizierung, Vaterschaftstests und Screening auf genetische Störungen sein. Alles, was mit DNA zu tun hat, kann in der Elektrophorese verwendet werden.

Sollten Datenbanken für DNA-Informationen eingerichtet werden? Datenbanken sollten für DNA-Informationen eingerichtet werden, solange sie anderen helfen und nicht missbraucht werden. Ein Vorteil davon wäre, genetische Störungen zu untersuchen oder in Gerichtsverfahren zu identifizieren, aber ein Nachteil wäre die Forschung, um zu versuchen, die DNA hinsichtlich ihres Aussehens zu verändern. Personen, die die Kontrolle über die Informationen haben sollten, sollten die Person sein, deren DNA gespeichert wird, und die Informationen sollten von vertrauenswürdigen Personen kontrolliert werden. Eine gute Person für den Job ist beispielsweise jemand, der die DNA-Bank nicht zu seinen Gunsten nutzt. Es sollte auch streng geschützt werden, da es sich um personenbezogene Daten handelt. DNA, die einem Verdächtigen zur Identifizierung entnommen wurde, sollte ausschließlich zur Identifizierung und nur zur Identifizierung verwendet werden. Nur bei Säuglingen mit einer genetischen Störung in der Familienanamnese sollte aus Sicherheits- und Frühpräventionsgründen bei der Geburt ein DNA-Fingerabdruck abgenommen werden.

Abschluss
Nach Durchführung dieses Experiments unter Verwendung von Farbstoffen kamen wir zu dem Schluss, dass der Kristallviolettfarbstoff am negativsten war. Wir kamen auch zu dem Schluss, dass Methylgrün am positivsten war. Dieses Experiment half uns, die Gelelektrophorese besser zu verstehen.


Schritt 1: Teile und Werkzeuge

Acrylmaterialien und Designdateien

Von jedem Lieferanten von Acrylmaterialien (McMaster-Carr, US Plastics usw.):

12" x 12" x 1/4" klares Acryl
12" x 12" x 1/4" blaues Acryl (oder bevorzugte Farbe)
5" x 5" x 1/8" klares Acryl

6" x 6" x 1/16" Teflonfolie, Kat. # 8545K13

1/8" Solacryl (UV-durchlässig) - Optional : Wenn Sie keine UV-durchlässige Gelschale benötigen, stellen Sie diese Teile einfach aus normalem klarem Acryl her.

Schneiden Sie die Teile mithilfe der unten angehängten Konstruktionsdateien aus Ihrem Material - die Art des zu verwendenden Materials ist im Titel der Datei angegeben. Wenn Sie keinen Zugang zu einem Laserschneider haben, können Sie die Dateien an jeden Laserschneiddienst senden (wir verwenden Pololu). Diese Dienste tragen auch das meiste Material, das Sie benötigen, mit Ausnahme von Solacryl. Sie können auch ein Kit in unserem Online-Shop (IO Rodeo , Cat #IMG-01) für 93 US-Dollar kaufen. Das Kit enthält alle lasergeschnittenen Teile und Hardware, Platindraht (anstelle von Edelstahldraht) und vormontierte Kämme. Sie müssen das Weld-On noch kaufen.

Hardware und Werkzeuge

2-56 Handgewindebohrer, Kat. # 2522A663
Gewindeschneider mit T-Griff, 0-1/4" (1,6-6,3 mm) Gewindebohrergröße, Kat.-Nr. 2546A22
2x 2-56 Nylon-Flachkopf-Maschinenschraube mit Schlitz, 3/16" Länge, Kat.-Nr. 93135A076
4x 2-56 Nylon-Flachkopf-Maschinenschraube mit Schlitz, 1/8" Länge, Kat.-Nr. 93135A074
Edelstahldraht, 0,01" Durchm. Kat.-Nr. 9882K31
2x 6/32 Sechskant-Maschinenmuttern Kat # 91841A007
2x Unterlegscheibe, Nr. 6 Schraubengröße, 5/16" Kat # 92141A008

IPS Aufschweißzement #3 oder 4, Kat. # 10792
Hypo-Typ-Lösungsmittelzement-Applikator, Kat.-Nr. 25658

2x Bananenstecker, Cat #655K-ND
Schwarzes Bananensteckerkabel, 36", Cat # 4771-36-0-ND
Rotes Bananensteckerkabel, 36", Cat # 4771-36-2-ND
4x Gummifüße, Kat. # SJ5012-0-ND

Anhänge


ERGEBNISSE

Empfohlenes Verfahren

Die Gelbox wird aus einem Kunststoff-Aufbewahrungsbehälter (14 × 20 × 5 cm, 1,6 L) hergestellt und mit Aluminiumfolienelektroden (1 × 25 cm vierlagiger Faltstreifen) im Abstand von 14 cm bestückt, mit Klebeband oder Kleber befestigt. Die Elektroden werden über Drähte mit Krokodilklemmen an fünf 9-V-Batterien in Reihe angeschlossen. Die Gele wurden in eine saubere Glasbackform (9 × 13 Zoll) gegossen, in die mit einem Wachsmalstift ein Rechteck (8,5 × 5,5 cm) gezeichnet wurde. Agar der Telefonmarke (1 g) wurde unter Verwendung eines Mikrowellenofens in 50 ml Laufpuffer (3 g L –1 Seachem Neutral pH Regulator) geschmolzen. Nach vorsichtigem Gießen des geschmolzenen Agars in das Buntstiftrechteck bis zum Füllen wurden ein Kamm aus einer Geschenkkarte aus einem Plastikgeschäft und Bindeklammern verwendet, um ungefähr 1 cm vom Ende des Gels entfernt Vertiefungen zu bilden. Nach dem Abkühlen des Gels (10–20 min) wurde der Kamm entfernt, das Gel aus der Gießschale gehoben, in die Gelbox mit den Vertiefungen nahe der Kathode gelegt und in Laufpuffer (bis 1 cm über dem Gel) eingetaucht. DNA-Proben (∼ 10 μL) wie eine Standard-Lambda-HindIII-Leiter (Fisher Scientific ∼ 1 $ pro Spur) oder genomischer Extrakt wurden 1:1 in Ladefarbstoff (ein Tropfen Maissirup mit drei Tropfen grüner Lebensmittelfarbe) mit einer Pipette gegeben. Die Elektrophorese wurde 1 bis 1,5 h lang durchgeführt, während die Wanderung der Tracking-Farbstoffe beobachtet wurde. Die Gele wurden 12 bis 72 Stunden lang ohne Schütteln bei Raumtemperatur in ein Gentianaviolettbad (10.000-fache Verdünnung) eingetaucht gefärbt. DNA-Banden wurden mit Hintergrundbeleuchtung sichtbar gemacht und zur weiteren Analyse fotografiert.

Typische Ergebnisse

Das Ergebnis einer typischen Geltrennung einer Lambda-HindIII-Leiter ist in Fig. 2 gezeigt. Beachten Sie, dass nach dem Färben diskrete Banden sichtbar sind, die jeweils ein unterschiedlich großes DNA-Fragment der Leiter darstellen. Die Schüler in unserem Klassenzimmertest waren erfolgreich bei der Visualisierung von DNA-Banden in ihren Gelen. Genomische DNA neigt dazu, diffuse Banden mit hohem Molekulargewicht zu bilden, kann aber auch mehr als eine Bande erzeugen. Diese können von unterschiedlicher Größe sein oder es können unterschiedliche Konformationen (z. B. Supercoiled) der genomischen DNA sein, die zu Veränderungen der elektrophoretischen Mobilität führen. Eine längere Elektrophorese verschiebt die DNA-Banden weiter in das Gel und sorgt für eine bessere Trennung. Ein breiterer Bereich von Bandengrößen kann erhalten werden, indem zuerst genomische DNA durch wiederholtes schnelles Passieren durch eine Spritzennadel oder durch Verwendung kommerziell erhältlicher Restriktionsenzyme geschert wird.

Terminplanung und Bewertung

Je nach Klingelzeitplänen ist es möglicherweise am besten, die Schritte im Protokoll in verschiedene Blöcke zu unterteilen. In unseren Versuchen wurde der erste Block für eine Übung zum Pipettieren und für Diskussionen über das Verfahren und seine Begründung verwendet. Die Gelboxen wurden konstruiert, Gele gegossen, geladen und im zweiten Block (unter Verwendung einer Lambda-HindIII-Leiter) laufen gelassen. Später entfernte der Lehrer die Gele aus der Färbung und lagerte diese für einen dritten Block ein, in dem die Bandenmuster dokumentiert und analysiert wurden. Die Schüler erhielten ein Arbeitsblatt, das sie ausfüllen mussten, während sie auf den Abschluss von Verfahren warteten, die Fragen zur Grundlage der Elektrophorese, zur negativ geladenen Rückgrat-DNA, die eine elektrophoretische Trennung ermöglicht, und zur Bestimmung der Moleküllängen durch Analyse der Bandenmuster enthielt. Offene Fragen, schülerzentrierte Antworten, angemessene Wartezeiten und nonverbale Verhaltensweisen wurden verwendet, um einen Dialog zu führen und Ideen zu entwickeln [ 15-18 ]. Die Schüler erstellten einen Standard-Laborbericht und wurden entsprechend ihrer kontinuierlichen Interaktionen während des Unterrichts benotet. Lehrer können das Verständnis der Schüler auch durch Erweiterungsprojekte beurteilen (siehe unten).

Studentenumfragen

Die Testklasse am NEM bestand hauptsächlich aus Studenten im zweiten Jahr in fünf Gruppen zu je 4–5 Schülern. Umfragen mit einer Likert-Skala wurden von allen 21 Schülern mit entsprechender Erlaubnis der Eltern und der Schule ausgefüllt (Tabelle I). Insgesamt lagen die Punktzahlen bei 4,0 oder höher, was darauf hindeutet, dass die Schüler die Aktivität schätzten und für wertvoll hielten. Die Werte waren signifikant (P < 0,05) höher als erwartet für jede Frage (außer Q13) unter Verwendung der Chi-Quadrat-Analyse und der Erwartung einer gleichmäßigen Verteilung über die Antworten. Die Schüler sahen die Aktivität als mit ihrer Kursarbeit verbunden und als aktuell an. Die Schüler fühlten sich aktiv beteiligt, lernten etwas Wertvolles und wollten mehr wissenschaftliche Untersuchungen durchführen. Die höchsten Punktzahlen waren sich einig, dass die Aktivität Spaß gemacht und gut organisiert war. Die Studenten waren nicht enttäuscht, dass bei der Aktivität kostengünstige Materialien anstelle von Laborgeräten verwendet wurden. Obwohl die durchschnittlichen Antworten positiv waren, hatten zwei der Schüler insgesamt niedrigere Punktzahlen, die knapp unter neutral (3,0) fielen. Zusammengenommen waren diese Umfrageergebnisse deutlich höher (P < 0,01) als erwartet und legen nahe, dass die Schüler die Elektrophorese-Aktivität als erfolgreich und als wertvolle Ergänzung zu einem Einführungskurs in Biologie an der High School ansahen. Inhaltserhebungen, die zuvor nach ähnlichen elektrophoretischen Aktivitäten mit Laborgeräten an NEM und anderen WPS-Hochschulen durchgeführt wurden, zeigten einen signifikanten Anstieg des aktivitätsspezifischen Inhaltswissens [ 11 ]. Es muss darauf hingewiesen werden, dass eine einzelne Unterrichtsaktivität für sich genommen nicht erwartet wird, dass sie die Leistung bei breit angelegten naturwissenschaftlichen Prüfungen oder den Gesamtkursnoten merklich steigert.

Frage Punktzahl ± SDa a Likert-Skala: 1 = stimme überhaupt nicht zu 2 = stimme nicht zu 3 = stimme weder zu noch stimme nicht zu 4 = stimme zu 5 = stimme voll und ganz zu.
1. Die Gellabor-Sitzungen waren gut organisiert 4.3 ± 0.8
2. Die experimentellen Schritte wurden gut erklärt 4.2 ± 0.8
3. Das Gellabor regte zur aktiven Teilnahme an 4.1 ± 0.9
4. Ich war motiviert, die Ergebnisse zu sehen 4.1 ± 0.9
5. Das Experiment hat für meine Gruppe gut funktioniert 4.1 ± 0.9
6. Ich war unzufrieden, dass wir kostengünstige Materialien verwendet haben 2.1 ± 1.0
7. Das Gellabor hat mich zum kreativen Denken angeregt 3.7 ± 0.8
8. Ich hatte das Gefühl, echte Nachforschungen anzustellen 3.5 ± 1.0
9. Der Einsatz neuer Laborgeräte weckt mein Interesse an der Wissenschaft 4.0 ± 0.9
10. Das Gellabor enthielt aktuelle Informationen 4.0 ± 0.9
11. Mein Lehrer konnte meine Fragen beantworten 4.1 ± 1.1
12. Das Gellabor hat mir geholfen, wichtige Konzepte zu verstehen 3.9 ± 0.9
13. Mein Verständnis von DNA ist nach dem Gellabor besser 3.7 ± 1.1
14. Ich habe gelernt, wie man Mikropipetten benutzt 4.0 ± 1.2
15. Ich habe das Gefühl, bei dieser Aktivität etwas gelernt zu haben 4.1 ± 0.8
16. Das Gellabor war für meine Klasse relevant 4.2 ± 0.8
17. Das Gellabor war ein wertvolles Lernwerkzeug 3.9 ± 1.0
18. Die Aktivität hat mich dazu gebracht, mehr Experimente zu machen 3.9 ± 1.0
19. Das Gellabor war von hoher Qualität 4.0 ± 0.8
20. Es hat Spaß gemacht, das Gellabor zu machen 4.3 ± 0.8
  • a Likert-Skala: 1 = stimme überhaupt nicht zu 2 = stimme nicht zu 3 = stimme weder zu noch stimme nicht zu 4 = stimme zu 5 = stimme voll und ganz zu.

Agarose- und Acrylamidgele

Die Polymerisation von Acrylamid wird durch Sauerstoff gehemmt. Diese Gele müssen daher senkrecht zwischen zwei Glasplatten gegossen werden, die von zwei Kunststoff-Abstandshaltern auseinandergehalten werden. Dieses Verfahren ist zeitaufwendig und technisch anspruchsvoller als die horizontale Agarosegelelektrophorese. Acrylamidgele haben jedoch ein ausgezeichnetes Auflösungsvermögen. Sie werden verwendet, wenn ein hoher Trennungsgrad (d. h. ein Größenunterschied von einem einzigen Basenpaar) erforderlich ist, wie zum Beispiel bei der Sequenzierung von DNA.

Elektrophorese-Puffer

DNA-Proben

Erkennung

Gele können entweder vor oder nach einem Elektrophoreselauf gefärbt werden. Um ein Gel vor einem Elektrophoreselauf zu färben, wird Ethidiumbromid zu der geschmolzenen Agarose gegeben, bevor sie auf die Gelschale gegossen wird. Diese Färbemethode ist die schnellste und bietet den Vorteil, dass die Position der DNA während der Trennung verfolgt werden kann. Alternativ kann das Gel nach dem Elektrophoreselauf 10–30 min in eine verdünnte Ethidiumbromidlösung gelegt werden.

Einflussfaktoren auf die Mobilität


Was ist Pulsfeld-Gelelektrophorese?

Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) ist eine Technik zur Trennung sehr großer DNA-Moleküle.

Unter Standard-Elektrophoresebedingungen wird ein elektrisches Feld in eine Richtung an das Agarosegel angelegt, und DNA-Moleküle, die größer als 40 Kilobasen sind, bewegen sich im Wesentlichen zusammen durch das Gel, unabhängig von ihrer Größe.

Im Gegensatz dazu legt PFGE ein elektrisches Feld an, das periodisch die Richtung ändert. Durch die Einführung eines Wechselspannungsgradienten an einem PFGE-System können sehr große DNA-Fragmente durch ihre Neuorientierung und Bewegung mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch das Gel getrennt werden. Größere DNA-Stücke richten ihre Ladung langsamer auf die Richtungsänderung aus, während kleinere Stücke schneller ausgerichtet sind, was zu einer größeren Trennung führt.

Erfolgreiche PFGE-Ausrüstung und -Bedingungen

Schauen wir uns die Ausrüstung und die Bedingungen genauer an, die zu einer erfolgreichen PFGE führen.

Hier befindet sich die Elektrophoresekammer, die den Laufpuffer enthält. Das Agarosegel sollte in der Mitte dieser Kammer gut verankert sein, damit es nicht herumschwimmt. Um das Gel herum befinden sich mehrere Elektrodenpaare, die in einem sechseckigen Raster angeordnet sind. Diese sechseckige Elektrodenform ermöglicht die Richtungsumschaltung der Spannung. Die Spannung wird periodisch zwischen drei Richtungen umgeschaltet: eine, die durch die Mittelachse des Gels verläuft, und zwei, die auf beiden Seiten in einem Winkel von 60 Grad verlaufen.

Die PFGE-Technik dauert aufgrund der Größe der DNA-Fragmente und weil sich die Fragmente nicht geradlinig bewegen, länger als die Standard-Gelelektrophorese.

Um eine Überhitzung des Agarosegels durch die längere Zeit unter dem elektrischen Feld zu verhindern, die zu einem Auflösungsverlust führen könnte, passt ein Kühlmodul die Temperatur des Puffers an. Ein typisches PFGE-Programm wird bei 14 oder 15 Grad Celsius durchgeführt. Es ist wichtig, dass keine Luft in den Schläuchen zum und vom Kühlmodul zurückbleibt.

Am Steuermodul kann das Migrationsprotokoll eingegeben und überwacht werden. Dazu gehören die Anfangs- und Endschaltzeiten, die Dauer der Wanderung, der Elektrophoresewinkel und die Spannung.

Je größer die DNA-Fragmente, desto länger sollten die Pulszeiten sein und desto länger die Gesamtmigrationszeit. Die Schaltzeit ist die Zeitdauer, in der das elektrische Feld in eine einzige Richtung gepulst wird. Eine Schaltzeit von 10 Sekunden bedeutet beispielsweise, dass das elektrische Feld 10 Sekunden lang in eine Richtung gepulst und dann 10 Sekunden lang in eine andere Richtung geschaltet wird.

Proben mit einem breiten Spektrum an DNA-Fragmentgrößen, wie NEB&rsquos PFG-Marker, können durch Hochfahren von einer kurzen Umschaltzeit auf eine längere im Laufe des Laufs aufgelöst werden.

Die meisten PFGE-Protokolle sind für Gelläufe mit 6 Volt pro Zentimeter und für einen 120-Grad-Winkel optimiert. Mit jedem PFGE-System können Sie je nach Migrationsprotokoll DNA-Fragmente oder -Moleküle von 10 Kilobasen bis 10 Megabasen trennen.

Hier sind Trennbeispiele des Lambda Mono Cut Mix, von 1,5 bis 48,5 Kilobasen, und Hefechromosomen, von 225 bis 1.900 Kilobasen.


Was ist Pulsfeld-Gelelektrophorese?

Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) ist eine Technik zur Trennung sehr großer DNA-Moleküle.

Unter Standard-Elektrophoresebedingungen wird ein elektrisches Feld in eine Richtung an das Agarosegel angelegt, und DNA-Moleküle, die größer als 40 Kilobasen sind, bewegen sich im Wesentlichen zusammen durch das Gel, unabhängig von ihrer Größe.

Im Gegensatz dazu legt PFGE ein elektrisches Feld an, das periodisch die Richtung ändert. Durch die Einführung eines Wechselspannungsgradienten an einem PFGE-System können sehr große DNA-Fragmente durch ihre Neuorientierung und Bewegung mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch das Gel getrennt werden. Größere DNA-Stücke richten ihre Ladung langsamer auf die Richtungsänderung aus, während kleinere Stücke schneller ausgerichtet sind, was zu einer größeren Trennung führt.

Erfolgreiche PFGE-Ausrüstung und -Bedingungen

Schauen wir uns die Ausrüstung und die Bedingungen genauer an, die zu einer erfolgreichen PFGE führen.

Hier befindet sich die Elektrophoresekammer, die den Laufpuffer enthält. Das Agarosegel sollte in der Mitte dieser Kammer gut verankert sein, damit es nicht herumschwimmt. Um das Gel herum befinden sich mehrere Elektrodenpaare, die in einem sechseckigen Raster angeordnet sind. Diese sechseckige Elektrodenform ermöglicht die Richtungsumschaltung der Spannung. Die Spannung wird periodisch zwischen drei Richtungen umgeschaltet: eine, die durch die Mittelachse des Gels verläuft, und zwei, die auf beiden Seiten in einem Winkel von 60 Grad verlaufen.

Die PFGE-Technik dauert aufgrund der Größe der DNA-Fragmente und weil sich die Fragmente nicht geradlinig bewegen, länger als die Standard-Gelelektrophorese.

Um eine Überhitzung des Agarosegels durch die längere Zeit unter dem elektrischen Feld zu verhindern, die zu einem Auflösungsverlust führen könnte, passt ein Kühlmodul die Temperatur des Puffers an. Ein typisches PFGE-Programm wird bei 14 oder 15 Grad Celsius durchgeführt. Es ist wichtig, dass keine Luft in den Schläuchen zum und vom Kühlmodul zurückbleibt.

Am Steuermodul kann das Migrationsprotokoll eingegeben und überwacht werden. Dazu gehören die Anfangs- und Endschaltzeiten, die Dauer der Wanderung, der Elektrophoresewinkel und die Spannung.

Je größer die DNA-Fragmente, desto länger sollten die Pulszeiten sein und desto länger die Gesamtmigrationszeit. Die Schaltzeit ist die Zeitdauer, in der das elektrische Feld in eine einzige Richtung gepulst wird. Eine Schaltzeit von 10 Sekunden bedeutet beispielsweise, dass das elektrische Feld 10 Sekunden lang in eine Richtung gepulst und dann 10 Sekunden lang in eine andere Richtung geschaltet wird.

Proben mit einem breiten Spektrum an DNA-Fragmentgrößen, wie NEB&rsquos PFG-Marker, können durch Hochfahren von einer kurzen Umschaltzeit auf eine längere im Laufe des Laufs aufgelöst werden.

Die meisten PFGE-Protokolle sind für Gelläufe mit 6 Volt pro Zentimeter und für einen 120-Grad-Winkel optimiert. Mit jedem PFGE-System können Sie je nach Migrationsprotokoll DNA-Fragmente oder -Moleküle von 10 Kilobasen bis 10 Megabasen trennen.

Hier sind Trennbeispiele des Lambda Mono Cut Mix, von 1,5 bis 48,5 Kilobasen, und Hefechromosomen, von 225 bis 1.900 Kilobasen.


Verweise

[1] Jones, T. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine 2003, 22 (6), 33–42. http://dx.doi.org/10.1109/memb.2003.1304999.

[2] Qian, C. Huang, H. Chen, L. Li, X. Ge, Z. Chen, T. Yang, Z. Sun, L. Internationale Zeitschrift für Molekularwissenschaften 2014, 15 (12), 18281–18309. http://dx.doi.org/10.3390/ijms151018281

[3] Hughes, M.P. Biomikrofluidik 2016, 10 (3), 032801. http://dx.doi.org/10.1063/1.4954841

[6] Voldman, J. Jahresrückblick Biomedizinische Technik 2006, 8 (1), 425–454. Doi: http://dx.doi.org/10.1146/annurev.bioeng.8.061505.095739

[7] Pethig, R. Zeitschrift der Elektrochemischen Gesellschaft 2016, 164 (5). Doi: http://dx.doi.org/10.1149/2.0071705jes

[8] Hsu, T.-R. MEMS und Mikrosysteme: Design, Herstellung und Nanotechnologie John Wiley: Hoboken, NJ, 2008.


Sollte die Länge der Elektroden in der Elektrophoresekammer proportional zur Kammergröße sein? - Biologie

PROTOKOLL FÜR DIE SDS-SEITE-ANALYSE

Arun Malik, Harnish, Priyanka Chopra, Stanzin Angmo und Hariom Yadav[*]

Nationales Institut für Agrar- und Lebensmittelbiotechnologie, Mohali, Punjab, Indien

In der Molekularbiologie weit verbreitete SDS-PAGE-Technik, die verwendet wird, um Proteine ​​entsprechend ihrer Länge einer linearen Polypeptidkette zu trennen. Die allgemeine Elektrophoresetechnik kann nicht verwendet werden, um das Molekulargewicht von biologischen Molekülen zu messen, aber diese Technik wird meistens verwendet, um die Molekülmasse zu messen. Der Begriff Elektrophorese bedeutet die Bewegung geladener Teilchen in ein elektrisches Feld. In einem elektrischen Feld Bewegung von Proteinen in Richtung einer Elektrode mit entgegengesetzter Ladung. Die Trennung von Proteinen nach ihrer Form, Größe erfolgt.

SDS-PAGE wurde beim Gießen der Gele durchgeführt, um Schwierigkeiten und Gefahren beim Arbeiten mit Acrylamid zu vermeiden. In diesem Protokoll Anwesenheit von SDS und Beta-Mercaptoethanol, das verwendet wird, um die Proteine ​​in ihre Untereinheiten zu denaturieren.

Abbildung. SDS-PAGE Prozessablauf

Stammlösungen: Auflösegel für 12% Lösung

  1. 30% Acrylamid/ Bis (37,5:1)
    Nehmen Sie 29,2 g Acrylamid + 0,8 g N,N - Bis-Methylen-Acrylamid. 100 ml Wasser dazugeben.
  2. 1,5 M Tris-HCL, pH-6.8
    Nehmen Sie 6 g Trizma-Base. pH 8,8 mit 6 N HCL einstellen. 60 ml Wasser dazugeben.
  3. 10 % (w/v) SDB
    Um 100 ml SDS herzustellen, nehmen Sie 10 g SDS und fügen Sie 90 ml Wasser hinzu.
  4. Destilliertes Wasser 3,35 ml.
  5. TEMED 5 Mikroliter.
  6. 10 % APS (Ammoniumpersulfat) 50 Mikroliter.

  1. PAGE Rigs beinhaltet Abstandhalter, Kämme, Glasplatten (10 x 20 cm).
  2. Proteinprobe.
  3. Probenpuffer mit SDS und entweder Saccharose oder Glycerin.
  4. 2-Mercaptoethanol.
  5. 1 X Laufpuffer

25 mM Tris-HCL
200 mM Glycin
0,1 % (w/v) SDB
Ungefähres Wasservolumen unter 1 Liter, das vom Elektrophoresesystem abhängt.

10 % (w/v) SDB
10 mM Dithiothreitol oder Betamercapto-Ethanol
20 % (v/v) Glycerin
0,2 M Tris-HCL, Ph-6,8
0,05 % (w/v) Bromphenolblau

Gel in Miniproteinkassette gießen

  1. Bereiten Sie ein auflösendes Gel vor und fügen Sie alle Reagenzien hinzu, um ein Gel herzustellen, außer TEMED und Ammoniumpersulfat (APS). Sobald TEMED und APS hinzugefügt sind, wird die Lösung mit in wenigen Minuten polymerisiert.
  2. Setzen Sie die Gießglasrahmen auf den Gießstrang. Gießen Sie das auflösende Gel zwischen Glasrahmen.
  3. Nach dem Gießen des Gels den Kamm vorsichtig einführen und bevor das Gel polymerisiert.
  4. Lassen Sie das Gel bis zu 25-30 Minuten polymerisieren, bis es fest wird.

Elektrophorese

  1. Nehmen Sie die Glasrahmen vom Gießstrang und bewahren Sie sie in der Elektrophoresekammer auf.
  2. Füllen Sie die Kammer mit Puffer und laden Sie die Proteinproben in die Gelnäpfe, dann schließen Sie die Elektrophoresekammer.
  3. Schließen Sie die roten und schwarzen Stromkabel an die farblich passenden Elektroden der Elektrodenbaugruppe an.
  4. Legen Sie eine Spannung von etwa 120 Volt an und wir können 12% Trenngel verwenden. Lassen Sie das Gel normalerweise etwa 40-50 Minuten laufen, bis der Bromphenolfarbstoff zum Boden des Gels gewandert ist.
  5. Entfernen Sie nach der Migration des Farbstoffbodens des Gels die Elektrodenbaugruppe.

Proteinanalyse und -nachweis

Visualisieren Sie das Protein mit Coomassie Brilliant Blue, Silberfärbung, oder wir können jede andere Proteinfärbung verwenden.


Wie funktioniert es?

Es gibt verschiedene Arten von PAGE-Techniken, die verwendet werden, aber die gebräuchlichste wird als SDS-PAGE bezeichnet. In SDS-PAGE wird das Detergens Natriumdodecylsulfat verwendet, um die Proteine ​​zu denaturieren und ihr Masse-zu-Ladungs-Verhältnis zu normalisieren. Ohne SDS würden sowohl das Molekulargewicht als auch die Ladung des Proteins seine Trennung im Gel beeinflussen. Bei SDS beeinflusst nur das Molekulargewicht die Migrationsgeschwindigkeit und dementsprechend trennen sich die Proben. PAGE ohne SDS wird als native PAGE bezeichnet, da die Proteine ​​in ihrer nativen Konformation bleiben.

Die Gelmatrix

Wie bei der Agarosegelelektrophorese werden die Proben mit einem elektrischen Feld getrennt und passieren eine Gelmatrix, die die Migration der Proteine ​​beeinflusst. In PAGE verwenden wir anstelle von Agarose eine Chemikalie namens Polyacrylamid. Durch Variieren des Polyacrylamid-Prozentsatzes im Gel können wir die Größe der Poren im Gel ändern, was bedeutet, dass wir verschiedene Proteingrößen in Gels mit unterschiedlichem Prozentsatz trennen können. Typische Gel-Prozentsätze sind in der Tabelle unten gezeigt.

Acrylamid-AnteilTrennauflösung
5 %60 – 220 Kd
7.5 %30 – 120 Kd
10 %20 – 75 Kd
12%17 – 65 Kd
15 %15 -45 Kd
17.5%12 – 30 Kd

Acrylamid wird normalerweise in flüssiger Form verkauft, da die Pulverform neurotoxisch und gefährlich in der Handhabung ist. Die Polymerisation wird durch Mischen von Acrylamid mit Bisacrylamid erreicht, wodurch sich Vernetzungen zwischen den Acrylamidmolekülen bilden können. Zur Initiierung der Polymerisation werden zusätzliche Chemikalien zugesetzt, in der Regel Ammoniumpersulfat als Quelle freier Radikale und TEMED als Stabilisator. Sobald die Polymerisation beginnt, wird das Gel zwischen 2 Glasplatten gegossen und vollständig polymerisieren gelassen.

Die Gelmischung wird nicht in Wasser, sondern in Elektrophoresepuffer (Tris-HCl) hergestellt, der die Ionen für die Elektrophorese bereitstellt. Oft wird das Gel in 2 Teilen gegossen. Der erste Teil ist ein sich auflösendes Gel mit einem pH-Wert von etwa 8,8, das die Migration der Proteine ​​verlangsamt. Über das Trenngel wird ein Sammelgel mit einem pH-Wert von 6,8 und einer größeren Porengröße gegossen. Dieses Sammelgel dient dazu, die Proteinproben zu einer dünnen Migrationsfront zu komprimieren, sodass alle Proteine ​​in der Probe gleichzeitig am Auflösungsgel ankommen, was zu einer genauen relativen Migration führt.

Laufen mit dem Gel

Anders als bei der Agarosegelelektrophorese, bei der die Gele in Schalen gegossen werden, werden sie horizontal gegossen, SDS-PAGE-Gele werden vertikal unter Verwendung einer Gießvorrichtung gegossen. Wir gießen die Gele auf diese Weise, so dass die Stapel- und Auflösegele ein kontinuierliches Gel bilden, was bei einem horizontalen Gel viel schwieriger wäre. Es ermöglicht auch, dass eine viel größere Proteinmenge auf das Gel geladen wird. Der Geltank ist ebenfalls in 2 Abschnitte unterteilt. Je nach Hersteller hat der Tank eine innere (oder obere) Pufferkammer und eine äußere (oder untere) Pufferkammer. Diese beiden Kammern sind durch das Gel verbunden, um einen kontinuierlichen Kreislauf zu bilden. Jede Kammer enthält eine Elektrode, negativ in der inneren Kammer und positiv in der äußeren Kammer. Die innere Kammer berührt die Oberseite des Gels, und wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, bewegen sich die Proteine ​​aufgrund der negativen Ladungen der SDS-Moleküle in Richtung der positiven Elektrode in der äußeren Pufferkammer. Typische Puffer für SDS-PAGE sind Tris-Glycin für die Pufferkammern und Tris-HCl für das Gel.

Die Bewegungsgeschwindigkeit durch das Gel wird dann durch den Spannungsgradienten, d. h. die Spannung zwischen den Elektroden, bestimmt. The required field strength is related to the size of the gel tank being used and the required voltage can be calculated using the simple equation E = V/d where E is the field strength, V the voltage and d the distance in cm between electrodes. Vertical gel tanks are generally run at 5 – 10 V / cm so if your tank has an electrode distance of 10 cm, you would run the gel at 50 – 100V. The exact value depends on your samples and should be determined empirically.

To apply this electrical field, we use a DC power supply. Most electrophoresis power supplies can be set to provide either a constant current or a constant voltage, with each having advantages and disadvantages. One potential issue is the production of heat due to the flow of current through the system which can be especially high with larger tanks that require higher voltage. For this reason, it is advisable to use some form of cooling, either passive in the form of a cooling block, or active such as a recirculating chiller, for larger electrophoresis systems.

Visualising the Protein

After migration, proteins must be visualised to determine their length and abundance. There are several methods commonly used to visualise proteins that are either specific or non specific. Non specific protein visualisation targets all proteins, using dyes that bind to common regions of the proteins such as the amino groups. Examples of non-specific protein stains include Coomassie Brilliant Blue and Ruby Pro. These stains are often non-reversible and can (but don’t always) interfere with downstream applications. Non-specific staining can be useful for quickly quantifying samples in a gel, or for ensuring a sample of interest is present.

To specifically visualise certain proteins, we need to use antibodies. Antibodies recognise unique 3 dimensional structures in the protein to distinguish them from others. By conjugating the antibody with a dye or enzyme, we can visualise just the protein that it recognises. The process of moving proteins from a gel to a membrane that can be probed with antibodies is called western blotting. To Learn more about western blotting, you can read our dedicated article soon. Whether you are western blotting or just non-specific staining, you will need to visualise the proteins using the gel documentation system. The type of system you use will vary based on whether you are using a visible stain like coomassie, or fluorescent or chemiluminescent dye attached to an antibody. As with agarose gel documentation systems, gel documentation systems for proteins can come in a variety of specifications depending on the requirements. For more advice on gel docs you can read our dedicated article.


Electrophoresis Lab

In this lab we explored DNA replication and electrophoresis. Through use of various DNA samples running through an Agarose gel with a lab controlled electric current, we aimed to view the effects of electrophoresis. Although most of our results were inconclusive, we were able to identify one band representing electrophoresis.

Electrophoresis is a process in which DNA, which is negatively charged, is placed in a gel where an electric current is applied. The DNA particles move towards the positive charge at different rates based on the size of the DNA fragments. (Wootton). In this lab, strands of lambda of unknown lengths were run through the gel. DNA fragments of shorter lengths are able to travel a longer distance. The length of each DNA fragment was determined based off of the distance travelled from the origin.

The lab was conducted at New Tech High at Coppell on January 27 and 28, 2016 in the AP Biology classroom. It was conducted in 3 parts: Part A, Part B, and Part C.

Part A, Casting the Agarose Gel:

  1. Seal the ends of the gel-casting tray with tape, insert the comb, and set it aside.
  2. Pour the solution to cover 5-6 mm, and make sure that it does not cover the comb. Before the gel sets, move any bubbles or debris aside with a pipette. Allow the gel to solidify, and do NOT move the gel or tray for the 15-20 minutes it takes.
  3. Unseal the tray and place in the gel box so that the comb is at the negative end. This is the black/cathode end. Fill the box with TAE buffer to cover the entire surface.
  4. Gently remove the comb, and clear any dimples with buffer.

Part B, Loading the Gel:

  1. Load the contents of the first tube into the pipet, and steady it in your hand.
  2. Expel any air in the tip before loading the DNA sample, then expel it slowly into the buffer, underneath the surface.
  3. Complete the steps above for each sample

Part C, Electrophorese:

  1. Close the chamber and connect it to a power supply, ensuring that both electrodes are connected to the same supply.
  2. Turn on the power supply. You should see the loading dye moving toward the positive pole.
  3. The DNA should electrophorese until the blue band is about 1 cm from the end of the gel.
  4. Turn off power supply, remove the leads, and remove the lid of the chamber.
  5. Measure the distance the blue stain moved down the gel.

HindIII EcoRI
Distance Travelled (cm) Actual Bp Distance Travelled (cm) Actual Bp
*27,491
1.9 *23,130 1.9 10,400
2.1 9,416 2.3 7,240
2.4 6,557 2.5 6,190
2.9 4,361 2.8 4,900
3.6 2,322 3.2 3,350
3.8 2,027 3.6 2,375
**564 3,350
**125

  1. Discussion: Answers to questions 1 – 9 -Sameen
  1. The points were excluded because they are outliers based on the standard curve. This tells us that some of the gels are different sizes and have different sensitivities, making them imperfect, and therefore subject to inconsistencies.
  2. You would use the 0.3% gel.
  3. You would use the 2-2.5% gels.
  4. You would have to make sure the voltage would be less than 100 volts so it would take longer for the gel to run.
  5. Either the charges were switched or the gel was simply flipped.
  6. It would most likely be the 1080 and the 1000 bps that make up the doublet as they are the closest to each other.
  7. The restriction enzyme looks for the specific sequence to splice the DNA.
  8. .
  9. Because the restriction enzymes look for specific sequences and splice the DNA at particular places, we can use the enzymes to identify the DNA by the segments they were spliced at.
  1. Conclusion: Summarize what your group learned: what is electrophoresis, why does it work, what is an RFLP, restriction enzyme, ligase, etc. -Rahi

Throughout this lab, we learned what electrophoresis is, and the methods to prove that it works. Electrophoresis is used to separate macromolecules like DNA or RNA by size, or proteins by their charge. We use RFLP, restriction fragment length polymorphism, analysis which is a method in which a DNA sample is broken down into smaller pieces by restriction enzymes. These resulting fragments are separated by their lengths in a process called gel electrophoresis. This experiment also helped us understand that ligase, a glue-like protein, repairs the two smaller enzymes back into one larger structure. For our group, the end results were good for the Lambda DNA, but all of the other DNAs were non-visible. Even though this happened, we got to understand how gel electrophoresis works, and how restriction enzymes take part in DNA production.


Schau das Video: gentechnische Verfahren 01 - Gelelektrophorese (Januar 2022).