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Probengröße des Lichtmikroskops


Ich ging Beispielfragen für die Wissenschaftsolympiade durch, und eine der Fragen lautete wie folgt:

Eine Zelle wird durch ein Lichtmikroskop bei 4-facher Vergrößerung beobachtet. Die Zelle nimmt etwa die Hälfte des Gesichtsfeldes ein. Wie lang ist dieser Organismus ungefähr?

Ich weiß aus Vorkenntnissen, dass eine Zelle zwischen 10 $ und 100 $ Mikrometer liegen kann, aber ich weiß nicht, wie ich die Größe einer Zelle mit den mir gegebenen Informationen ermitteln soll. Normalerweise bekomme ich bei solchen Problemen die Größe des Sichtfelds. Ist das nicht nötig, um dieses Problem zu lösen?


Probengröße des Lichtmikroskops - Biologie

Das links abgebildete Gizmo ist eine große Sache. Es eröffnete Wissenschaftlern buchstäblich Welten von Organismen und Informationen. Seine Bedeutung in der Geschichte der Medizin und unser Verständnis von Krankheiten sollte nicht unterschätzt werden.
Dieses Ding ist ein zusammengesetztes Lichtmikroskop.
Für Sie, den Biologiestudenten, ist es vielleicht das wichtigste Werkzeug, das Sie verstehen müssen. Wenn Sie damit fertig sind, mit diesen Seiten zu spielen (und Ihren Text zu lesen und im Unterricht aufmerksam zu sein), sollten Sie in der Lage sein:

DIE TEILE
Ordne die Namen in der Wortdatenbank den nummerierten Teilen im Bild zu.


Arm
Base
Körperrohr
Grobfokusknopf
Membran
Feinfokusknopf
Objektiv mit hoher Leistung
Lichtquelle
Objektiv mit geringer Leistung
Nasenstück
Okular (Okular)
Bühne
Bühnenclips

Nachdem Sie die Zahlen und Ihre Antworten notiert haben, überprüfen Sie Ihre Arbeit Hier.

WAS DIE TEILE TUN
Jetzt ist es an der Zeit sich einprägen die Funktion jedes Mikroskopteils.
Um Ihnen beim Üben zu helfen, ist hier eine passende Übung.


Arm
Base
Körperrohr
Grobfokusknopf
Membran
Feinfokusknopf
Objektiv mit hoher Leistung
Lichtquelle
Objektiv mit geringer Leistung
Nasenstück
Okular (Okular)
Bühne
Bühnenclips
1. Die Linse, durch die Sie schauen, vergrößert die Probe
2. unterstützt das Mikroskop
3. hält Objektivlinsen
4. Vergrößern Sie die Probe (2)
5. unterstützt die oberen Teile des Mikroskops, die zum Tragen des Mikroskops verwendet werden
6. verwendet, um zu fokussieren, wenn das Hochleistungsobjektiv verwendet wird
7. wo die Folie platziert ist
8. reguliert die Lichtmenge, die das Objektiv erreicht
9. verwendet, um zu fokussieren, wenn das Objektiv mit geringer Leistung verwendet wird
10. spendet Licht
11. rutsche auf der bühne festhalten

Vergrößerung mag-ne-fe-'ka-shen n 1. scheinbare Vergrößerung eines Objekts 2. das Verhältnis von Bildgröße zu tatsächlicher Größe
Eine Vergrößerung von "100x" bedeutet, dass das Bild 100 mal größer als das eigentliche Objekt.

Auflösung ez-e-loo-shen n 1. Klarheit, Schärfe 2. die Fähigkeit eines Mikroskops, zwei sehr nahe Punkte getrennt darzustellen

1. Warum wird ein "zusammengesetztes" Lichtmikroskop genannt?
"Compound" bezieht sich nur auf die Tatsache, dass es zwei Linsen gibt, die das Objekt gleichzeitig vergrößern, das Okular und eine der Objektivlinsen.

2. Wenn immer zwei Linsen das Präparat vergrößern
(siehe Nr. 1), wie ermitteln Sie die verwendete Gesamtvergrößerung?
Sie multiplizieren die Stärke des Okulars und die Stärke des verwendeten Objektivs. Gesamtmag. = Okular x Objektiv Wenn beispielsweise das Okular 10x und das Objektiv mit geringer Vergrößerung 20x ist, dann beträgt die Gesamtvergrößerung bei geringer Vergrößerung 10 x 20 = 200x.
Einfach, nicht wahr?

3. Wie trägt man eines dieser Dinge?
Mit zwei Händen, eine hält den Arm und die andere unter der Basis. Ein bisschen wie ein Fußball. (Sie sind teuer, wir wollen sie nicht fallen lassen.)

4. Wie sieht es mit der Fokussierung aus? Wie machst du das ?
Hier ist, was ich vorschlage. Sobald Sie Ihre Folie auf der Bühne platziert haben, stellen Sie sicher, dass die Objektiv mit geringer Leistung (das kürzeste Objektiv) ist in Position und drehe die grob Fokus bis sich die Linse an einer Position befindet, die der Bühne am nächsten ist. Stellen Sie die Blende auf die größte Öffnung (dort, wo das meiste Licht durchgelassen wird). Beginnen Sie dann, während Sie durch das Okular schauen, langsam den Grobfokus zu drehen. Langsam drehen & aufmerksam beobachten. Wenn die Probe mit geringer Leistung fokussiert wird, bewegen Sie den Objektträger so, dass das, was Sie sehen möchten, ist Totpunkt in Ihrem Sichtfeld und wechseln Sie dann zu einem Objektiv mit höherer Leistung. Berühren Sie den Grobfokus NICHT noch einmal --- Sie werden etwas kaputt machen! Wenn Sie ein Hochleistungsobjektiv verwenden, fokussieren Sie NUR mit dem Feinfokussierknopf. Stellen Sie sicher, dass Sie Ihre Probe zentrieren, bevor Sie zu einem Objektiv mit höherer Leistung wechseln, da es sonst verschwinden kann. Mehr dazu in einer Minute.

MIKROSKOPISCHE MESSUNGEN

Schätzen der Probengröße :
Der Bereich des Objektträgers, den Sie beim Blick durch ein Mikroskop sehen, wird als "Sichtfeld" bezeichnet. Wenn Sie wissen, wie groß Ihr Sichtfeld ist, können Sie die Größe der Dinge schätzen, die Sie im Sichtfeld sehen. Die Breite des Sichtfelds zu bestimmen ist einfach --- alles was Sie brauchen ist ein dünnes metrisches Lineal.

Durch vorsichtiges Platzieren eines dünnen metrischen Lineals auf der Bühne (wo normalerweise ein Dia platziert würde) und Fokussieren unter geringer Strom, können wir das Sichtfeld in Millimetern messen. Durch das Mikroskop würde es ungefähr so ​​aussehen, wie Sie es hier links sehen. Die Gesamtbreite des Sichtfeldes beträgt in diesem Beispiel weniger als 1,5 mm. Eine faire Schätzung wäre 1,3 oder 1,4 mm.
(Entspann dich, es ist ein schätzen).

Millimeter ist eine schöne metrische Einheit, aber wenn wir ein MIKROskop verwenden, neigen wir dazu, MIKROmeter zu verwenden. Um von Millimetern in Mikrometer umzurechnen, verschieben Sie die Dezimalstelle um 3 Stellen nach rechts. Unsere Schätzung von 1,3 mm wird zu 1300 Mikrometern.

Jetzt können wir das Lineal aus dem Weg räumen, eine Folie vorbereiten, fokussieren und die Größe der Dinge schätzen, die wir sehen! (Aufregend, nicht wahr?)

Wenn beispielsweise etwas, das wir betrachten, die Hälfte des Sichtfelds einnimmt, wäre seine Größe ungefähr 1/2 x 1300 Mikrometer = 650 Mikrometer. Wenn etwas 1/5 des Sichtfeldes zu sein scheint, würden wir seine Größe auf 1/5 x 1300 = 260 Mikrometer schätzen.

Berechnen der Probengröße :
Da sich das Hochleistungsobjektiv so nah am Tisch befindet, können wir die Weite des Sehfelds bei hoher Leistung nicht direkt messen. Das Lineal passt einfach nicht zwischen das Objektiv und die Bühne. Kein Problem. Wir können die Weite des Sichtfelds bei niedriger Leistung (die wir mit den obigen Schritten messen) und die Beziehung zwischen den niedrigen und hohen Vergrößerungen verwenden, um die Breite des Sichtfelds bei hoher Leistung mathematisch zu berechnen.

Merken Sie sich zunächst Folgendes:

Zum Beispiel: Wenn das Objektiv mit geringer Leistung 20x und das Objektiv mit hoher Leistung 40x ist, dann sehen wir bei hoher Leistung 20/40 oder 1/2 der Fläche des Objektträgers, die wir bei geringer Leistung gesehen haben.

Dies ist etwas, das etwas Übung erfordert. Also los gehts. Berechnen Sie die Antworten zu diesen Beispielen auf einem Papier und klicken Sie dann auf "Antworten".
(Sie erfahren mehr, wenn Sie es zuerst selbst ausprobieren.)

Beispiel 1:

Augenstärke = 10x
Objektiv mit geringer Leistung = 20x
Hochleistungsobjektiv = 50x

a) Was ist die höchste Vergrößerung, die Sie mit diesem Mikroskop erreichen können?
b) Wenn der Durchmesser des Schwachfeldes 2 mm beträgt, wie groß ist der Durchmesser des Sehfeldes mit hoher Leistung in mm? in Mikrometern?
c) Wenn 10 Zellen Ende an Ende in das Sichtfeld mit geringer Leistung passen, wie viele dieser Zellen würden Sie dann bei hoher Leistung sehen?

Augenstärke = 10x
Objektiv mit geringer Leistung = 10x
Hochleistungsobjektiv = 40x

Die Abbildung zeigt die Kante eines Millimeterlineals unter dem Mikroskop mit den oben aufgeführten Linsen. Das gezeigte Feld ist das Sichtfeld mit niedriger Leistung.

a) Wie groß ist die ungefähre Weite des Gesichtsfeldes in Mikrometern?
b) Wie groß wäre das Sichtfeld bei hoher Leistung?
c) Wenn 5 Zellen über das Hochleistungs-Sichtfeld passen, wie groß ist dann ungefähr jede Zelle?

okular = 10x
Objektiv mit geringer Leistung = 20x
Hochleistungsobjektiv = 40x

Das Bild zeigt das Low-Power-Sichtfeld des Mikroskops mit den oben aufgeführten Objektiven.
a) Wie groß ist die Zelle ungefähr in Mikrometern?
b) Was wäre das Hochleistungssichtfeld?
c) Wie viele Zellen wie die im Bild passen in das Hochleistungs-Sichtfeld?

HOFFNUNG, SIE HABEN EINE Tonne gelernt.
HALTEN SIE SICH FERN AN.

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Verwenden des Mikroskops : die Antworten

Antworten auf DIE TEILE :
1) Sockel 2) Lichtquelle 3) Blende 4) Bühne 5) Bühnenclips
6) Low-Power-Objektiv 7) High-Power-Objektiv 8) Objektivrevolver 9) Arm 10) Feinfokussierknopf 11) Tubus 12) Grobfokussierknopf 13) Okular (Okular)



Antworten auf 'WAS DIE TEILE TUN' :
1. okular
2. Basis
3. Nasenstück
4. Objektiv mit geringer Leistung, Objektiv mit hoher Leistung
5. Arm
6. Feinfokusknopf
7. Stufe
8. Membran - Das sind übrigens die NYS Regents Favorit Mikroskopteil
9. Grobfokusknopf
10. Lichtquelle (Lampe oder Spiegel)
11. Bühnenclips

Antworten auf 'WAS SIE SEHEN' :
ANTWORT auf Beispiel #1:

Augenstärke = 10x
Objektiv mit geringer Leistung = 20x
Hochleistungsobjektiv = 50x

a) Was ist die höchste Vergrößerung, die Sie mit diesem Mikroskop erreichen können? 500x
Okular x hohe Leistung = 10 x 50 = 500. (Wir können nur 2 Linsen gleichzeitig verwenden, nicht alle drei.)
b) Wenn der Durchmesser des Feldes geringer Leistung 2 mm beträgt, wie groß ist der Durchmesser des Gesichtsfeldes hoher Leistung in mm? .8 mm
Das Verhältnis von geringer zu hoher Leistung beträgt 20/50. Bei hoher Leistung sehen Sie also 2/5 des Sichtfelds mit niedriger Leistung (2 mm). 2/5 x 2 = 4/5 = 0,8 mm
in Mikrometern? 800 Mikrometer
Um mm in Mikrometer umzurechnen, verschieben Sie die Dezimalstelle um 3 Stellen nach rechts (mit 1000 multiplizieren). 0,8 mm x 1000 = 800 Mikrometer
d) Wenn 10 Zellen Ende an Ende in das Sichtfeld mit geringer Leistung passen, wie viele dieser Zellen würden Sie bei hoher Leistung sehen? 4 Zellen.
Wir können diese Frage auf die gleiche Weise beantworten, wie wir oben bei "b" vorgegangen sind. Bei hoher Leistung würden wir 2/5 des niedrigen Feldes sehen. 2/5 x 10 Zellen = 4 Zellen würden bei hoher Leistung gesehen werden.

<zurück zum Beispiel #1

Augenstärke = 10x
Objektiv mit geringer Leistung = 10x
Hochleistungsobjektiv = 40x

Die Abbildung zeigt die Kante eines Millimeterlineals unter dem Mikroskop mit den oben aufgeführten Linsen. Das gezeigte Feld ist das Sichtfeld mit niedriger Leistung.

a) Wie groß ist die ungefähre Weite des Gesichtsfeldes in Mikrometern? 3500 - 3800 Mikrometer
Jeder Leerraum beträgt 1 mm. Wir können ungefähr 3 1/2 (oder so) weiße Räume sehen. Das entspricht 3,5 mm, also 3500 Mikrometer. Jede Antwort im obigen Bereich wäre in Ordnung.
b) Wie groß wäre das Sichtfeld bei hoher Leistung?
875 Mikrometer
Das Verhältnis von niedriger zu hoher Leistung bei diesem Mikroskop beträgt 10/40 oder 1/4. Bei hoher Leistung sehen wir also 1/4 des Sichtfelds mit niedriger Leistung. 1/4 x 3500 Mikrometer (von "a" oben) = 875 Mikrometer.
c) Wenn 5 Zellen über das Hochleistungs-Sichtfeld passen, wie groß ist dann ungefähr jede Zelle?
175 Mikrometer
Wenn 5 Zellen in das Sichtfeld mit hoher Leistung passen (das wir in "b" mit 875 Mikrometern bestimmt haben), dann ist die Größe von 1 Zelle = 875/5 = 175 Mikrometer.

<zurück zu Fragen #2

okular = 10x
Objektiv mit geringer Leistung = 20x
Hochleistungsobjektiv = 40x

Das Bild zeigt das Low-Power-Sichtfeld des Mikroskops mit den oben aufgeführten Objektiven.

a) Wie groß ist die Zelle ungefähr in Mikrometern?
500 Mikrometer
Zuerst müssen wir uns vorstellen, wie viele dieser Zellen über das Feld passen könnten – ungefähr 4. Also 2 mm (die Breite des Feldes) / 4 = 0,5 mm, was 500 Mikrometer entspricht.
b) Was wäre das Hochleistungssichtfeld?
1000 Mikrometer
Das Verhältnis von geringer zu hoher Leistung für dieses Zielfernrohr beträgt 20/40 oder 1/2. Wir sehen also 1/2 des Feldes mit niedriger Leistung unter hoher Leistung. 1/2 x 2 mm = 1 mm, umgerechnet in 1000 Mikrometer.
c) Wie viele Zellen wie die im Bild passen in das Hochleistungs-Sichtfeld?
2 Zellen
Auch hier beträgt das Verhältnis von niedriger zu hoher Leistung 20/40 oder 1/2. Wenn wir im unteren Sichtfeld 4 Zellen sehen können, sehen wir im hohen Sichtfeld 1/2 so viele. 1/2 x 4 = 2 Zellen.

<zurück zu Frage #3


MIKROSKOPIE | Lichtmikroskopie und histochemische Methoden

Grundsätze

Das Lichtmikroskop ist ein Instrument zur Visualisierung feiner Details eines Objekts. Dies geschieht durch die Erzeugung eines vergrößerten Bildes durch die Verwendung einer Reihe von Glaslinsen, die zuerst einen Lichtstrahl auf oder durch ein Objekt fokussieren, und konvexen Objektivlinsen, um das erzeugte Bild zu vergrößern. Bei den meisten Lichtmikroskopen wird das Bild direkt durch binokulare Okulare betrachtet, die als sekundäre Linse in Form einer Lupe zur Beobachtung des projizierten Bildes dienen. Solche Instrumente werden als „Verbundmikroskope“ bezeichnet, und die Gesamtvergrößerung ist die Summe aus Objektivvergrößerung und Okularvergrößerung. Der Vergrößerungsbereich reicht von ×10 bis ×1000, mit einem Auflösungsvermögen in der Größenordnung von 0,2 µm, je nach Typ und numerischer Apertur (für den Lichtdurchtritt verfügbare Fläche) der Objektivlinsen. Es gibt eine Reihe von Büchern, die umfassende Informationen zur Theorie des Lichtmikroskops und Anleitungen zum praktischen Gebrauch des Instruments einschließlich Methoden zur Bildverbesserung und Instrumentenpflege bieten. Der Leser wird für weitere Informationen auf diese, insbesondere eine umfangreiche Reihe von Handbüchern der Royal Microscopical Society, verwiesen.


Die Geheimnisse der Lichtbogenbeleuchtung

Obwohl in den letzten Jahren eine Reihe spezialisierter Implementierungen für verschiedene Forschungsanwendungen entstanden sind, bleiben das Grundkonzept und die wesentlichen Bausteine ​​ähnlich wie in frühen LSFM-Publikationen. Die Beleuchtungsoptik formt einen Laserstrahl zu einer dünnen Lichtscheibe, die sich über das gesamte Sichtfeld des Mikroskops erstreckt. Anstatt ein statisches Lichtblatt zu verwenden, erzeugen moderne LSFM-Implementierungen ein „virtuelles“ Lichtblatt durch digitales Scannen eines einzelnen Laserstrahls seitlich durch die Abbildungsebene der Probe.

Aufgrund der Lichtbeugung ist ein Lichtblatt nur in der Mitte des Sichtfeldes dünn. Je dünner das Lichtblatt in der Mitte ist, desto schneller nimmt seine Dicke zu den Seiten zu. Die Dicke des Lichtblattes muss daher an die Größe des Sehfeldes angepasst werden, was ein modernes Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop mit automatisierter Zoomoptik im Beleuchtungsstrahlengang bewältigt. Außerdem verformen opake und streuende Proben das Lichtblatt, wenn es durch die Materie wandert. Wenn das Lichtblatt das entfernte Ende der Probe erreicht, ist es oft erheblich dicker als optimal, was durch eine Beleuchtung der Probe aus der entgegengesetzten Richtung vermieden werden kann. Beispielsweise verwendet die duale Beleuchtungsoption von Lightsheet 7 zwei gegenüberliegende Beleuchtungsobjektivlinsen, um die Probe aus zwei entgegengesetzten Richtungen zu beleuchten, und lindert somit effizient das Problem der Lichtblattverschlechterung in der Probe.

Die seitliche Beleuchtung eines Lichtblattmikroskops kann streifenförmige Bildartefakte erzeugen, bei denen es sich um Schatten von absorbierenden Partikeln in der Probe handelt, die sich seitlich durch ein Bild erstrecken. Diese Streifen können reduziert werden, indem das Lichtblatt schnell um die Probe herum geschwenkt wird, so dass die Probe entlang einer sich ständig ändernden Richtung beleuchtet wird. Durch das Schwenken wird die Richtung der Schatten im Bild variiert und bei einer schnellen Richtungsänderung die Schatten verteilt, bis sie praktisch verschwinden.

Beim Durchgang des Lichtblattes durch die Probe werden einige Strukturen der Probe, z.B. Kerne, das Anregungslicht absorbieren oder streuen. Dadurch werden Schatten entlang der Beleuchtungsachse geworfen, wie Sie in der linken Abbildung sehen. Dieser Effekt tritt bei allen Fluoreszenzmikroskopen auf, aber die Beleuchtungsachse bei der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie steht senkrecht zur Beobachtungsachse und somit ist dieser Effekt deutlicher.

Bei Lightsheet 7 verändert ein patentierter Pivot-Scanner den Winkel des Lightsheets während der Bildaufnahme nach oben und unten. Durch Veränderung des Beleuchtungswinkels werden die Schatten in unterschiedliche Richtungen geworfen und das Anregungslicht erreicht auch Bereiche hinter undurchsichtigen Strukturen, wie Sie in der rechten Abbildung sehen. Dieser patentierte Pivot-Scanner ist eine perfekte Möglichkeit, artefaktfreie Bilder zu erfassen und nachgelagerte Verarbeitungs- und Analyseschritte zu verbessern. Es ist immer besser, Artefakte direkt an ihrem Ursprung anzugehen.


Probengröße des Lichtmikroskops - Biologie

Das Mikroskop ist ein Werkzeug, das es uns ermöglicht, die Strukturen und Gewebe, aus denen Organismen bestehen, in sehr feinen Details zu sehen. Oft ist es möglich, die Funktion einer Struktur anhand ihrer mikroskopischen Morphologie zu verstehen. Wenn man beispielsweise die Ausrichtung von Muskelzellen in der Körperwand eines Regenwurms sieht, kann man verstehen, wie er sich bewegt und gräbt. Sie werden auch starke Beweise zur Unterstützung der Zelltheorie sehen.

Gebrauchsanweisung für das Hochleistungsmikroskop:

  • Tragen Sie das Mikroskop so, dass eine Hand den Hals umfasst und die andere den Boden stützt.
  • Wenn Sie einen neuen Objektträger auf den Objektträger legen oder einen Objektträger entfernen, sollten Sie immer das kürzeste Objektiv mit geringer Brechkraft zum Objekttisch zeigen.
  1. Halten Sie einen vorbereiteten Objektträger gegen das Licht und sehen Sie, wo sich die Probe unter dem Deckglas befindet.
  2. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskoplicht eingeschaltet ist und die dem Objekttisch zugewandte Objektivlinse mit geringer Leistung eingerastet ist. Heben Sie das Kondensorlinsensystem, das sich unter dem Tisch befindet, in seine oberste Position. Die Kondensorlinsen bündeln das Licht durch das Loch in der Bühne.
  3. Zentrieren Sie die Probe über dem Licht, das durch das Loch im Objekttisch aufkommt.
  4. Heben Sie die Bühne in die oberste Position. (Low-Power-Objektiv ist in Position!)
  5. Schauen Sie durch die Okularlinse des Mikroskops und stellen Sie das Licht so ein, dass es für Ihre Augen angenehm ist. Alle Mikroskope sind mit einer Irisblende unter dem Objekttisch ausgestattet, die die Lichtdurchlässigkeit verringert. Senken Sie nun den Objekttisch langsam mit dem großen, groben Fokussierknopf ab.
  6. Irgendwann sollte das Präparat scharfgestellt werden.
  7. Sie können jetzt zu einem Ziel mit höherer Leistung wechseln. Diese Mikroskope sind parfokal und bleiben somit im Fokus.
  8. Stellen Sie die Irisblende so ein, dass das Licht für Sie angenehm ist und Sie Details erkennen können.
  9. Fokussieren Sie bei hoher Leistung nur mit dem kleinen, feinen Fokussierknopf .

So erhalten Sie das bestmögliche Bild:

  • Verwenden Sie zum Reinigen des Okulars und der Objektivlinsen ein von uns geliefertes Linsentuch. Verwenden Sie kein anderes Papier. Möglicherweise müssen Sie auch die Folie reinigen.
  • Beginnen Sie immer mit dem Fokussieren des Mikroskops mit dem Grobfokussierknopf mit geringer Leistung. Diese Mikroskope sind parfokal. Das bedeutet, dass die anderen Objektive nach sorgfältiger Fokussierung mit dem Low-Power-Objektiv nahezu perfekt fokussiert sind. Sie müssen das Objekt zentrieren, bevor Sie die Objektive wechseln, um die Vergrößerung zu erhöhen, da das Sichtfeld kleiner wird, wenn das Objekt seitlich liegt, und es kann verschwinden, wenn Sie zu einer höheren Vergrößerung wechseln.
  • Für eine optimale Anzeige bei hoher Leistung ist weißes Licht unerlässlich. Verwenden Sie den Rheostat, um die Spannung an der Glühbirne zu erhöhen. Wenn es heller wird, wird das Licht weniger rot und mehr weiß. Das Schließen der Blende, durch die das Licht fällt, erhöht die Detailauflösung, die Sie sehen können. Verwenden Sie die Irisblende , die durch einen Hebel zwischen den Kondensorlinsen betätigt wird, um die Größe der Blende zu ändern. Je höher die Brechkraft des Objektivs, desto geringer ist die Schärfentiefe.

Die Gesamtvergrößerung, die Sie sehen, kann berechnet werden. Suchen Sie die auf dem Ring um die Okularlinse aufgedruckte Vergrößerung - sie ist wahrscheinlich 10x. Suchen Sie dann die auf dem verwendeten Objektiv aufgedruckte Vergrößerung - wahrscheinlich ist es entweder 4x, 10x oder 40x. Multiplizieren Sie die Vergrößerung der Okularlinse mit der des Objektivs, dies ist die Gesamtvergrößerung, die Sie sehen. Die Qualität des Mikroskops liegt in seinen Objektiven. Wenn sie schrecklich sind, wird das Vergrößern dessen, was sie durch die Okularlinse sehen, keine Verbesserung bringen. Wichtig ist, dass die Objektivlinsen nicht nass werden. Trocknen Sie sie sofort, wenn Wasser oder Flecken vom Objektträger auf die Linse übertragen werden.

  1. Stellen Sie sicher, dass das Objektiv mit geringer Vergrößerung richtig positioniert ist, bevor Sie einen Objektträger vom Objekttisch entfernen und bevor Sie das Mikroskop weglegen.
  2. Fassen Sie beim Abziehen des Mikroskops am Stecker, nicht am Kabel.
  3. Mikroskope sind nummeriert und sollten in der Nische mit der gleichen Nummer im Mikroskopschrank verstaut werden.
  4. Legen Sie die vorbereiteten Folien in die Kartons zurück und legen Sie sie in den Schlitz, dessen Nummer mit der in der oberen rechten Ecke der Folie übereinstimmt.

Brief e. Halten Sie diesen Schieber gegen das Licht und Sie sehen ein kleines Stück Schreibmaschinenpapier unter der Mitte des Deckglases. Darauf steht ein e. Beginnen Sie mit dem Low-Power-Objektiv (das kürzeste) an Ort und Stelle. Zentrieren Sie dieses Blatt Papier im Licht, das durch den Objekttisch Ihres Mikroskops einfällt, und fokussieren Sie das e mit dem großen, groben Fokussierknopf. Sie werden sofort sehen, dass das e auf dem Kopf und nach hinten steht, genau umgekehrt wie Sie es auf der Bühne ausgerichtet haben. Verantwortlich für diese Umkehrung sind die Mikroskopobjektive. Erhöhen Sie bei zentriertem e die Vergrößerung auf mittlere Leistung. Der Fokus ist fast korrekt. Stellen Sie das e neu ein und schärfen Sie den Fokus wieder mit dem Grobfokussierknopf. Erhöhen Sie nun die Vergrößerung auf hohe Leistung. Stellen Sie den Fokus nur mit dem kleineren Feinfokussierknopf ein. Verwenden Sie niemals den Grobfokussierknopf, wenn Sie mit hoher Leistung arbeiten, da Sie das Objektiv leicht durch den Schieber zerquetschen können – ein kostspieliger Fehler. Beginnen Sie den Vorgang immer mit geringer Leistung und erhöhen Sie dann die Vergrößerung der Objektivlinsen. Sie werden bemerkt haben, dass das Sehfeld umso kleiner und dunkler ist, je höher die Vergrößerung des Objektivs ist. Bei hoher Leistung müssen Sie die Helligkeit der Lichtquelle maximieren und die Irisblende regulieren.

Blitzende Seide. Dies ist ein kleines Quadrat aus feinem Seidenstoff. Untersuchen Sie es mit geringer Leistung und erhöhen Sie dann die Vergrößerung. Verwenden Sie bei hoher Leistung die Irisblende, um die Auflösung zu verbessern. Sie sehen viel mehr Details, wenn das Licht durch eine sehr kleine Öffnung geleitet wird. Denken Sie daran, wenn Sie in zukünftigen Laboren fast transparente Organismen betrachten. Heben und senken Sie den Objekttisch mit dem Feinfokussierknopf, um ein Gefühl für die Dicke des Stoffes zu bekommen.

Millimeterregel. Legen Sie den transparenten Millimeterstab auf den Objekttisch des Mikroskops. Beobachten Sie die Länge des Durchmessers in Millimetern des Sichtfelds bei jeder verfügbaren Vergrößerung. Füllen Sie die folgende Tabelle aus:

ZielsetzungVergrößerungDurchmesser (mm)
geringer Strom
mittlere Leistung
hohe Energie

Im Jahr 1665 verwendete Robert Hooke das Wort Zelle, was kleine Räume bedeutet, um die kleinen Hohlräume zu beschreiben, die durch Wände aus Kork, der Rinde eines Baumes, getrennt sind. Matthias Schleiden, ein Botaniker, veröffentlichte (1838) seine Schlussfolgerung, dass alle Pflanzen aus Zellen bestehen im folgenden Jahr (1839), Theodor Schwann weitete die Beobachtung auf tierische Gewebe aus und schlug eine zelluläre Grundlage allen Lebens vor. Der Pathologe Rudolf Virchow fügte 1858 eine wichtige Erweiterung der Theorie hinzu, dass alle lebenden Zellen aus bereits existierenden lebenden Zellen hervorgehen und es keine spontane Bildung von Zellen aus unbelebter Materie gibt. Wenn Sie mit dem Mikroskop Gewebe betrachten, die die 5 oder 6 Königreiche von Organismen repräsentieren, bestätigen Sie die Gültigkeit der Zelltheorie. Es erscheint seltsam, dass etwas so Offensichtliches mit moderner Technologie entdeckt und als Theorie vorgeschlagen werden musste.

Tierzellen – Wange. Nehmen Sie einen sauberen Objektträger und geben Sie einen kleinen Tropfen Jodfleck darauf. Verwenden Sie einen sterilen Holzstab und reiben Sie die Spitze sanft über die Innenseite Ihrer Wange. Am Ende des Stäbchens wurden Zellen gesammelt, die kurz vor dem Ablösen standen. Schwenken Sie das Ende des Sticks in das Jod auf dem Objektträger, um die Zellen zu übertragen und zu färben. Legen Sie ein Deckglas auf das Präparat und betrachten Sie es mit dem Mikroskop. Denken Sie daran, mit dem eingesetzten Objektiv mit geringer Vergrößerung zu beginnen. Die Zellen sind unregelmäßig. Sie können flache Oberflächen sehen, wo sie auf andere Zellen in Ihrer Wange treffen. Die Grenze einer Zelle, die Plasmamembran, ist so dünn, dass man nur sehen kann, wo die Zelle endet. Der Kern ist orange-braun gefärbt und befindet sich in jeder Zelle nahe der Mitte. Winzige Punkte auf der Oberfläche sind wahrscheinlich Bakterien.

Pflanzenzellen – Zwiebel. Geben Sie einen Tropfen Jodfleck auf einen sauberen Objektträger. Nehmen Sie eine Zwiebelschicht und verwenden Sie eine Skalpellspitze, um die sehr dünne Zellschicht zu schälen, die ihre innere Krümmung auskleidet. Die zwischen Fingerspitze und Skalpell gehaltene Schale sollte wie ein extrem dünnes Zellophan sein. Legen Sie die Schale in das Jod auf dem Objektträger und legen Sie ein Deckglas darüber. Betrachten Sie die Präparation mit dem Mikroskop. Diese Zellen haben eine recht regelmäßige Form und sind von einer dicken Zellwand umgeben. Da die Zellen das Wandmaterial sezernierten, befindet sich die Plasmamembran der Zelle innerhalb der Wand. Kerne werden wie in den tierischen Zellen gefärbt, aber sie befinden sich an der Seite der Zelle. Das Zentrum jeder Pflanzenzelle wird von einer großen transparenten Organelle eingenommen, die als zentrale Vakuole bezeichnet wird. Sie können es nicht sehen, aber Sie können das Ergebnis seiner Anwesenheit sehen: Der Kern befindet sich seitlich.

Zellenabmessungen: Verwenden Sie die Informationen in der obigen Tabelle, in der Sie den Durchmesser des Sehfelds bei jeder Vergrößerung bestimmt haben, um ungefähr den durchschnittlichen Durchmesser einer Wangenzelle und die Länge und Breite einer Zwiebelzelle zu messen.

Protista. Wenn Kulturen der Einzeller verfügbar sind, einen Tropfen auf einen neuen Objektträger geben und vorsichtig ein Deckglas darauf legen. Untersuche mit dem Mikroskop.


Lichtmikroskop und Elektronenmikroskop

Aufgrund ihrer winzigen Größe ist es schwierig, die Zelle oder ihre Bestandteile zu sehen. Die Entdeckung der Zelle war also mit der Erfindung des Mikroskops verbunden. Auch das Sehen von Zellbestandteilen war mit dem interessanten Vergrößerungsvermögen verbunden.

Die Untersuchung der Zellstruktur wurde mit der Erfindung des Elektronenmikroskops mit einer hohen Vergrößerungsleistung gekrönt. Es gibt also zwei Arten von Mikroskopen, das Lichtmikroskop und das Elektronenmikroskop.

Lichtmikroskop

Bis 1950 war das Lichtmikroskop das einzige Gerät, das Wissenschaftlern zur Verfügung stand, um die Mikroorganismen zu untersuchen. Es ist auf Sonnenlicht oder künstliches Licht angewiesen, um zu arbeiten.

Funktionen des Lichtmikroskops:

  • Vergrößern vieler Mikroorganismen und nicht lebender Dinge .
  • Untersuchung großer Objekte nach dem Schneiden in sehr dünne Scheiben, die das Licht durch sie hindurch lassen.

Vergrößerungsleistung vergrößert die Objekte bis zum 1500-fachen ihrer tatsächlichen Größe , Die Vergrößerung hängt von der Vergrößerungsleistung der Okular- und Objektivlinsen ab, Das Lichtmikroskop kann die Objekte nicht mehr als 1500-fach vergrößern, da das Bild unscharf (unscharf) wird.

Mikroskop-Vergrößerungsstärke = die Vergrößerungsstärke der Okularlinse × die Vergrößerungsstärke der Objektivlinse

Methoden, um mit einem Lichtmikroskop ein möglichst klares Bild zu erhalten:

Wissenschaftler fanden heraus, dass die beste Methode, um die Proben genauer zu untersuchen, die Erhöhung des Kontrasts zwischen verschiedenen Teilen der Proben ist durch:

  • Die Verwendung von Farbstoffen zum Färben oder Färben bestimmter Teile der Probe, um klarer zu sein, aber diese Farbstoffe töten die lebenden Proben (Nachteile).
  • Ändern der Lichtstärke .

Mit dem zusammengesetzten Lichtmikroskop werden die kleinen Dinger und deren Inhalt vergrößert und untersucht.

Lichtmikroskop und Elektronenmikroskop

Elektronenmikroskop

Im Jahr 1950 begannen Wissenschaftler, das Elektronenmikroskop zu verwenden. Die Idee seiner Arbeit beruht auf der Verwendung eines Strahls von Hochgeschwindigkeitselektronen anstelle des Lichts. Diese Elektronen werden von den elektromagnetischen Linsen gesteuert. Die Vergrößerung vergrößert die Objekte um das Millionfache ihrer tatsächlichen Größe . .


Mikroskop

EinführungMikroskope sind nützlich, um Objekte zu betrachten, die zu klein sind, um ohne Vergrößerung klar zu sehen. Diese Übung soll die Schüler mit der Verwendung eines zusammengesetzten Lichtmikroskops vertraut machen.

Zusammengesetztes Lichtmikroskop

Das zusammengesetzte Lichtmikroskop verwendet zwei Linsensätze, um das Objekt zu vergrößern. Die Beleuchtung erfolgt durch eine Lichtquelle am Fuß des Mikroskops. Die Vergrößerung reicht typischerweise von ungefähr 40 X bis 1.000 X. Sie können mit Objekten verwendet werden, die eine Größe von ungefähr 100 nm bis 2 mm aufweisen.

Teile des Lichtmikroskops

Der Objekttisch ist eine Plattform, die den Objektträger mit der zu betrachtenden Probe hält. Ein mechanischer Tisch (siehe Fotos unten) verfügt über einen Mechanismus zum Bewegen des Objektträgers.

Ein Lichtmikroskop muss eine Lichtquelle haben. Dies ist normalerweise eine Glühbirne, die sich unter der Bühne befindet.

Eine verstellbare Blende unter der Bühne wird verwendet, um die Lichtmenge zu regulieren, die durchgelassen wird.

Ein Kondensor enthält zwei Linsensätze, die das Licht konzentrieren. Es befindet sich direkt unter der Bühne. Licht von der Lichtquelle passiert die Blende und den Kondensor, bevor es durch die zu betrachtende Probe nach oben gelangt.

Der Körpertubus enthält eine Okularlinse (Okular) und einen Objektivrevolver mit mehreren Objektiven. Jedes Objektiv wird für eine andere Vergrößerung verwendet und durch Drehen des Objektivrevolvers in Position gebracht. Das Bild wird durch Einstellen der Grob- und Feinfokussierknöpfe scharf gestellt.

Binokulare Mikroskope (unten) haben zwei Okulare Monokulare Mikroskope (oben) haben ein Okular. Der Abstand zwischen den beiden Okularlinsen eines binokularen Mikroskops kann an den Augenabstand angepasst werden.

Andere optische Geräte wie binokulare Teleskope und Ferngläser verfügen ebenfalls über zwei Okularlinsen, die sich ähnlich wie das Mikroskop verstellen. Binokularlinsen lassen sich individuell einstellen, sodass viele Menschen ihre Brille nicht benötigen.

Zusammengesetzte Lichtmikroskope enthalten zwei Linsensysteme, ein Objektiv und ein Okular. Die Gesamtvergrößerung eines Bildes wird berechnet, indem die Vergrößerung des Okulars mit der Vergrößerung des Objektivs multipliziert wird. Die von uns verwendeten Mikroskope verfügen jeweils über eine 10X-Okularlinse und vier verschiedene Objektive, die in der folgenden Tabelle aufgeführt sind.

Objektive Vergrößerung Gesamtvergrößerung

Hohe Leistung 40 X oder 43 X 400 X oder 430 X

Ölimmersion 100 X 1000 X

Licht verbiegt sich beim Übergang von Glas zu Luft oder von Luft zu Glas, weil Luft und Glas unterschiedliche Brechungsindizes haben. Die Biegung des Lichts, wenn es durch den Glasobjektträger zur Luft und dann zur Glaslinse gelangt, verringert das Auflösungsvermögen. Bei hoher Vergrößerung (1000X) kann es verhindern, dass ein klares Bild angezeigt wird. Diese Abnahme der Auflösung kann verhindert werden, indem Immersionsöl zwischen Objektträger und Linse gegeben wird, da Immersion den gleichen Brechungsindex wie Glas hat.

Der Kondensor erhöht auch das Auflösungsvermögen des Mikroskops. Bei Verwendung des Ölimmersionsobjektivs sollte der Kondensor (der sich unter dem Objekttisch befindet) für eine maximale Auflösung sehr nahe am Objekttisch angehoben werden.

Der unten stehende Link kann vor der Verwendung des Mikroskops hilfreich sein.

VORSICHT - Verwenden Sie niemals Stoff oder Papierprodukte (Papiertücher, Seidenpapier usw.), um die Linsen zu reinigen. Sie zerkratzen die Beschichtung und verringern das Auflösungsvermögen der Linse. Verwenden Sie nur Linsenpapier.

Schalten Sie das Mikroskop auf die niedrigste Vergrößerung oder heben Sie die Objektive vom Tisch, bevor Sie einen Objektträger einsetzen. Dadurch wird verhindert, dass die Objektivlinse versehentlich vom Objektträger zerkratzt wird.

Legen Sie den zu betrachtenden Objektträger auf den Objekttisch und zentrieren Sie die Probe über der Öffnung.

Beginnen Sie entweder mit dem Scanobjektiv oder dem Objektiv mit geringer Leistung.

Heben Sie den Objekttisch (oder senken Sie das Objektiv) ganz an, damit sich der Objektträger so nah wie möglich an der Objektivlinse befindet.

Use the coarse adjustment know to slowly raise the lens from the stage while viewing the image. Fine focusing is not needed when using the lowest magnification (scanning or 4X objective). If you are using any of the other objectives, it will be necessary to use the fine focus after using the coarse focus.

Adjust the condenser so that a sharp focus is produced. This step is important at the highest magnification (oil immersion or 1000X).

Adjust the iris diaphragm. This will need readjustment after changing to a different magnification.

To Increase the Magnification

The microscopes are parfocal, meaning that after you adjust the focus, the image will remain approximately in focus if you change the magnification.

Center the object before switching to a higher power objective. This will help you find the object after switching the objective.

Switch to the next highest power. It will be necessary to center the image again. The image should be approximately in focus but it will be necessary to use the fine focus. The coarse focus should not be needed after switching objectives.

This procedure is repeated each time you switch to a higher magnification.

The 100 X objective (1,000X total magnification) requires that a drop of immersion oil be placed between the slide and the lens.

After focusing the specimen under high power (400X or 430X, see above), rotate the high power objective out of the way and place a drop of immersion oil on the slide. Rotate the oil immersion objective into place so that it touches the oil.

Adjust the fine focus, condenser, and iris diaphragm as previously described.

After viewing with oil, the lens must be cleaned with fluid designated for this purpose. Remember, use lens paper only. Never use cloth, paper towels, or other paper products on coated optics.

Laboratory Exercise - Practice Using the Microscope

If you are working with partners on this exercise, be sure that everybody in your group uses the microscope.

Obtain a slide of colored threads and view them under the scanning and low power. Use the focusing procedure described above.

1) Can you tell which thread is above the other?

View the threads under high power (400X or 430X). Use the fine focus to focus to determine the order of the threads from top to bottom. As you rotate the fine focus, different strands will go out of focus while others will become more sharply focused. This procedure will therefore enable you to determine the order of the threads.

2) Are all of the threads in focus at the same time?

3) What is the order (from top to bottom)?

"Depth of field" refers to the thickness of the plane of focus. With a large depth of field, all of the threads can be in focused at the same time. With a smaller or narrower depth of field, only one thread or a part of one thread can be focused, everything else will be out of focus. In order to view the other threads, you must focus downward to view the ones underneath and upward to view the ones that are above.

4) What happens to the depth of field when you increase to a higher magnification (increases, decreases, or remains the same)?

5) Explain how the slide with threads could be used to answer the question above.


Talk Overview

This lecture covers the lenses of the microscope and how they are used to focus light onto a specimen and how light from the specimen is focused onto a camera or the retina of an eye. Koehler illumination, which provides even illumination of a sample, is described.

Fragen

  1. List three planes in the microscope that are conjugate to image forming planes.
  2. List three planes in the microscope that are conjugate to the illumination (light source) plane
  3. Why do you want to set up Koehler illumination?

Answers

  1. Sample plane, back focal plane of the tube lens (which can be an intermediate image plane or the plane where the camera sensor is positioned), field diaphragm (iris) of the condenser, retina of the eye of observer
  2. Light source, front focal plane of the condenser (aperture iris/diaphragm), back focal plane of the objective, pupil of the eye of the observer
  3. Provide homogeneous, even illumination, be sure that planes in the illumination part of the microscope are correctly aligned with planes in the imaging part of the microscope (essential for many contrasting techniques such as phase and DIC)

Acknowledgements

We thank the mechanical and electronics workshop of the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) for customized hardware D. Holzer, T. Schneidt and H. Gustafson for help with the flies and G. Heuvelman and M. Wachsmuth for discussions on optics. We thank S. DeRenzis and the Wieschaus laboratory for the Gap43-mCherry flies and E. Lemke for hardware support. We thank J. Ellenberg for his helpful comments on the manuscript and anonymous reviewers for their constructive comments. We acknowledge the advanced light microscopy facility of EMBL for its kind support. We are grateful for financial support from EMBL, the EMBL Interdisciplinary Postdocs Program (EIPOD) and the Center for Modelling and Simulation in the Biosciences (BIOMS).


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Keywords : light-sheet fluorescence microscopy, SPIM, microdevices, microfluidics, cellular imaging

Citation: Albert-Smet I, Marcos-Vidal A, Vaquero JJ, Desco M, Muñoz-Barrutia A and Ripoll J (2019) Applications of Light-Sheet Microscopy in Microdevices. Vorderseite. Neuroanat. 13:1. doi: 10.3389/fnana.2019.00001

Received: 27 September 2018 Accepted: 09 January 2019
Published: 25 January 2019.

Stéphane Pagès, Wyss Center for Bio and Neuroengineering, Switzerland

Giancarlo Ruocco, Istituto Italiano di Tecnologia (IIT), Center for Life NanoScience, Italy
Daniel A. Peterson, Rosalind Franklin University of Medicine and Science, United States

Copyright © 2019 Albert-Smet, Marcos-Vidal, Vaquero, Desco, Muñoz-Barrutia and Ripoll. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) and the copyright owner(s) are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms.


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